聚合物整體柱微萃取/超高效液相色譜法測定蜂蜜中的4種磺胺類藥物

成小丹，范哲鋒

（山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是人工合成的抗生素，由于其抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉和供應(yīng)充足等優(yōu)點，在醫(yī)藥工業(yè)和畜牧業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用［1］。但在生產(chǎn)食物的動物中濫用這些藥物可能造成毒性影響，SAs在食物鏈中累積會對人體產(chǎn)生不良反應(yīng)，如抑制白細胞生成、損害泌尿系統(tǒng)和過敏反應(yīng)等［2－3］。目前在許多動物來源的食物中發(fā)現(xiàn)了SAs殘留物（如蜂蜜）［4－5］。由于食品中抗生素的種類多、濃度低，要檢測其中的SAs殘留仍需發(fā)展方便有效的富集分離技術(shù)。

目前色譜法是檢測食品中SAs的常用技術(shù)［6－7］，由于樣品的復(fù)雜性且SAs殘留量低，有必要對樣品進行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理。目前，已提出了液液萃?。↙LE）［8］、單滴微萃取［9］、固相萃?。⊿PE）［10］、磁固相萃?。∕SPE）［11］、攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）［12］和固相微萃?。⊿PME）［13］等前處理方法。SPME以無溶劑萃取、樣品消耗量少、微型便攜、操作簡單靈活等優(yōu)點得到了廣泛應(yīng)用［14］。萃取介質(zhì)是萃取過程中的關(guān)鍵因素，整體柱材料、磁性材料、分子印跡材料、共價有機骨架材料等新型材料已被用于SAs殘留的前處理過程［15］。聚合物整體柱是由功能性單體、致孔劑、交聯(lián)劑和引發(fā)劑的混合溶液在預(yù)烯基化的載體內(nèi)部通過自由基引發(fā)原位聚合而成的連續(xù)床固定相，具有連續(xù)多孔、pH適用范圍寬、萃取容量高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點［16－18］。馮鈺琦課題組在2006年提出了聚合物整體柱微萃?。≒MME）的前處理方法［19］，該方法結(jié)合了SPME和整體柱的優(yōu)勢，具有良好的發(fā)展前景。

本文制備了聚（4-乙烯基苯甲酸-二乙烯基苯-4-乙烯基苯基硼酸）（poly（VBA-DVB-VPBA））整體柱，合成的整體柱官能團豐富，可通過離子交換、疏水作用、氫鍵和B－N配位等多種作用形式對磺胺類藥物進行萃取富集。通過優(yōu)化萃取條件，建立了poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱微萃取/超高效液相色譜（PMME/UPLC）測定蜂蜜中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺吡啶和磺胺噻唑的分析方法，為食品中SAs的提取分離提供了技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀（UPLC，美國Agilent公司）；Varian 660紅外光譜儀（FT－IR，美國瓦里安公司）；JSM－7500F掃描電鏡（SEM，日本電子株式會社）；HL－2S恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）；色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm i.d.，1.8μm，美國Agilent公司）；玻璃毛細管（1 000μm i.d.，南通醫(yī)太科學(xué)儀器商店）。

磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺噻唑（STZ）購于源葉生物科技有限公司，用甲醇配制成1 mg/mL的儲備液，于4℃冰箱保存；二乙烯基苯（DVB）、3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（硅烷偶聯(lián)劑KH－570）、偶氮二異丁腈（AIBN）、甲醇（色譜純）、4-乙烯基苯甲酸（VBA）和4-乙烯基苯硼酸（VPBA）購于阿拉丁試劑有限公司；甲苯（分析純，洛陽市化學(xué)試劑廠）；丙酮（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為超純水（18.25 MΩ·cm，四川優(yōu)普超純科技有限公司），其它試劑均為分析純。

1.2 Poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱的制備及表征

Poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱通過熱引發(fā)自由基聚合法制備。將玻璃毛細管依次用1 mol/L NaOH溶液、HCl溶液浸泡12 h活化內(nèi)壁后，用水和丙酮清洗；將活化后的毛細管中注滿硅烷偶聯(lián)劑KH－570的丙酮溶液（30%，體積分數(shù)），放置24 h進行硅烷化修飾，而后用丙酮沖洗并干燥；將40 mg VBA、20 mg VPBA、90μLDVB、250μL甲醇、100μL甲苯和10 mg AIBN混合，超聲后將上述聚合液注入玻璃毛細管中，封閉兩端在烘箱60℃下反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后將制備好的整體柱用甲醇沖洗除去未反應(yīng)的原料，切割為5 cm備用。

將poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱去除玻璃外殼，切割成表面平整的3～5 mm切片進行制樣測試，通過掃描電鏡（SEM）觀察整體柱的微觀形態(tài)，并結(jié)合能量色散光譜法（EDX）對材料的化學(xué)成分和元素含量進行檢測；將整體柱研磨成粉末，在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT－IR）分析表面官能團。

1.3 分析方法

取適量SAs標準儲備液，以水為溶劑配制0～200 ng/mL的系列混合標準溶液，使用poly（VBADVB-VPBA）整體柱進行萃取富集。萃取前用甲醇和水將整體柱沖洗活化，樣品溶液用恒流泵上樣，用甲醇洗脫目標物后進行分析。為提高整體柱對SAs藥物的萃取性能，采用0.1μg/mL SAs的混合標準樣品分別優(yōu)化萃取條件，使用超高效液相色譜－二極管陣列檢測器（UPLC－DAD）進行分離檢測，通過色譜峰峰面積對萃取性能進行評價。

色譜條件：流動相為甲醇－水（20∶80，體積比）；流速為0.1 mL/min；柱溫為30℃；DAD檢測波長263 nm；自動進樣器進樣1μL；峰面積由數(shù)據(jù)分析處理軟件積分獲得。所有溶液在檢測前均過0.22μm濾膜，流動相使用前需進行超聲脫氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 Poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱的性能表征

采用SEM觀察了整體柱的截面形貌（圖1A），整體柱表面無明顯裂縫，可用于后續(xù)實驗操作；圖1B顯示合成的整體柱具有交聯(lián)的骨架結(jié)構(gòu)，內(nèi)部連續(xù)多孔、結(jié)構(gòu)均勻疏松，說明該柱通透性良好。用EDX觀察其元素含量和分布狀況（圖1C），光譜中具有元素B、C、O的衍射峰，可以清楚地觀察到各元素的能譜圖。元素分析結(jié)果表明，該柱的硼、碳、氧含量分別為15.84%、71.91%和12.03%。在整體柱的FT－IR譜圖中（圖1D），3 445、2 923、1 698 cm－1處的吸收峰分別對應(yīng)O—H、C—H和C=O鍵的伸縮振動吸收峰；1 603、1 508、1 487 cm－1處的吸收峰是苯基的特征譜帶；1 416 cm－1處的吸收峰歸屬于B—O鍵。以上特征吸收峰證明成功合成了poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱。

圖1 Poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱的掃描電鏡圖（A、B）、元素分布圖（C）及傅里葉紅外光譜圖（D）Fig.1 SEMimages（A，B），EDX elemental mapping（C）and FT－IR spectrum（D）of the poly（VBA-DVB-VPBA）monolithic column

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1pH值的優(yōu)化磺胺類藥物具有芳氨基和磺酰胺基，多為兩性化合物，樣品的酸堿度在吸附過程中會影響吸附劑的表面電荷以及分析物的存在形式，從而影響萃取效率［20］?？疾炝瞬煌琾H值（3、4、5、6、7、8）對萃取性能的影響，如圖2A所示，4種SAs的峰面積隨pH值從3增至4而增大，而后隨pH值的升高逐漸減小?？赡茉蚴莗H值小于4時，SAs中的氮原子被質(zhì)子化，只有π－π和疏水相互作用，有助于SAs的富集。隨著樣品pH值的增大，SAs中的氮原子逐漸發(fā)生去質(zhì)子化過程，吸附劑中的羧基發(fā)生解離，因此增加了陽離子交換和B－N配位相互作用。隨著氮原子的完全去質(zhì)子化和吸附劑中硼酸基團的解離，吸附性能逐漸下降。因此選擇最佳pH值為4。

2.2.2上樣體積的優(yōu)化在上樣流速為0.5 mL/min時，考察了不同上樣體積（1、2、3、4、5 mL）對萃取性能的影響。如圖2B所示，4種SAs的峰面積隨上樣體積的增大而增加，當(dāng)上樣量為5 mL時色譜峰面積還在增加，說明未達到整體柱的飽和萃取容量。但樣品量增大會使得萃取時間增加，因此選擇最佳上樣體積為3 mL。

2.2.3離子強度的優(yōu)化SAs是極性化合物，因此鹽度會影響其萃取性能［21］。通過加入不同質(zhì)量濃度的NaCl（0、30、60、90、120 g/L）考察了離子強度對萃取性能的影響。如圖2C所示，溶液中NaCl的質(zhì)量濃度低于60 g/L時，鹽析效應(yīng)導(dǎo)致目標物在水溶液中的溶解度降低，促使目標物轉(zhuǎn)移到萃取介質(zhì)上，從而提高了萃取效果；當(dāng)NaCl的質(zhì)量濃度大于60 g/L后，鹽濃度增加使得溶液的粘度增大，鹽分子開始與目標物相互作用，極性分子可能參與溶液中鹽離子的靜電相互作用，進而降低目標物進入萃取介質(zhì)的能力，不利于萃取。因此選擇最佳離子強度為60 g/L NaCl。

2.2.4洗脫體積的優(yōu)化以甲醇作為洗脫溶液，洗脫流速為0.3 mL/min，考察了不同洗脫體積（200、250、300、350、400、450μL）對萃取性能的影響。如圖2D所示，200μL洗脫溶液可將目標物完全洗脫下來，隨著洗脫溶液體積的增加，目標物被稀釋，峰面積也隨之降低。因此選擇最佳洗脫體積為200μL。

圖2 實驗條件對poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱微萃取0.1μg/mL SAs性能的影響（n=3）Fig.2 Effects of extraction conditions on poly（VBA-DVB-VPBA）monolith microextraction performance for 0.1μg/mL SAs（n=3）

2.3 分析性能

配制一系列質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/L的4種SAs混合標準溶液，在最佳實驗條件下采用本方法進行測定，以各分析物的相對峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x，mg/L）制作標準曲線（表1）。結(jié)果顯示，磺胺嘧啶的線性范圍為40～200 ng/mL，磺胺噻唑、磺胺吡啶和磺胺二甲基嘧啶的線性范圍為60～200 ng/mL；相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。以萃取后分析物的校準曲線斜率與萃取前的斜率之比為富集因子（EF），得到該整體柱的富集因子為10.97～12.82。以聚合物整體柱萃取的SAs量占原樣品溶液中SAs的比例為萃取率［22］，得到該整體柱的萃取率為73.1%～85.5%。

表1 Poly（VBA-DVB-VPBA）與UPLC聯(lián)用測定4種SAs的分析性能參數(shù)Table 1 Analytical performances of the proposed method for the determination of four SAs

分別以線性范圍下限濃度時萃取所得峰面積標準偏差的3倍和10倍除以校準曲線的斜率計算檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），4種SAs的LOD為8.32～16.2 ng/mL，LOQ為27.5～53.9 ng/mL。將該方法與文獻報道的SAs檢測方法進行對比（表2），結(jié)果表明本方法具有相對較寬的線性范圍和較低的檢出限，低于歐盟（EU）和中國農(nóng)業(yè)部等規(guī)定的總磺胺類藥物的最高殘留水平（MRL）100 ng/g［23］，且本方法具有整體柱制備簡單、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

表2 該方法與其它SAs分析方法的比較Table 2 Comparison of this work with reported methods for the determination of SAs

2.4 實際樣品的測定

按照本方法對購于當(dāng)?shù)爻械姆涿蹣悠愤M行分析，將樣品用McIlvaine緩沖液（pH 4）處理，離心過濾后待萃取檢測，并加入60.0、100 ng/mL的SAs混合標準溶液進行加標回收實驗。由表3可見，蜂蜜樣品中未檢出4種SAs，其加標回收率為89.8%～105%，相對標準偏差（RSD，n=5）為2.0%～7.2%，表明該方法可行且有效。空白蜂蜜樣品及加標樣品的色譜圖見圖3。

圖3 空白蜂蜜樣品（a）、加標60.0 ng/mL樣品（b）以及加標100 ng/mL樣品（c）的色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank honey sample（a），spiked with 60.0 ng/mL sample（b）and spiked with 100 ng/mL sample（c）

表3 蜂蜜樣品中4種SAs的檢測結(jié)果及回收率Table 3 Analytical results and recoveries of four SAs in honey sample

3 結(jié) 論

本文制備了poly（VBA-DVB-VPBA）整體柱，該柱制備簡單，成本低廉且作用形式多樣。通過對萃取條件的優(yōu)化，建立了測定蜂蜜中4種SAs的PMME/UPLC方法。該方法有機溶劑用量少、線性范圍寬、檢出限低、回收率好，可用于蜂蜜中磺胺類藥物的富集和監(jiān)測，且有望用于各種食品中SAs的萃取分析。