SERS結(jié)合光譜法研究正壬酸香草酰胺與人血清白蛋白的相互作用

周家羽，周光明，陳 蓉，羅 丹

（西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

藥物及其他生物活性化合物對(duì)人體血液循環(huán)系統(tǒng)蛋白質(zhì)成分的影響是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。眾所周知，藥物與血液成分的相互作用不僅會(huì)影響藥物的生物利用度，還會(huì)影響生物分子的功能，對(duì)藥理活性產(chǎn)生重大影響［1－3］。大多數(shù)藥物的生物活性和藥理活性可以通過藥物與蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行研究。較高的血漿循環(huán)水平和白蛋白具有結(jié)合多種化合物的能力，但通常認(rèn)為藥物與白蛋白的相互作用是主要的作用方式［4］，而光譜技術(shù)作為藥物-白蛋白相互作用研究的主要手段引起了人們的極大興趣［5－7］。

辣椒素是具有鎮(zhèn)痛止癢、抗炎消腫與抗腫瘤等作用的辣椒果實(shí)次生代謝產(chǎn)物［8］。正壬酸香草酰胺（Nonivamide，OC）與辣椒素有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用，可在神經(jīng)生理、藥理學(xué)研究中用作其替代物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)［9］。目前關(guān)于OC的大部分研究主要集中于合成或間接評(píng)估OC的應(yīng)用方面，有關(guān)OC與血清白蛋白之間相互作用的研究較少。人血清白蛋白（HSA）是人血漿中最豐富的血漿蛋白（約45 mg/mL），具有配體結(jié)合特性、抗氧化功能和酶活性［10－11］，負(fù)責(zé)將各種氨基酸、藥物分子、脂肪酸及其代謝物結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至其分子靶位［12］。盡管HSA結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但其分子中僅含有一個(gè)色氨酸殘基（Trp214），這一特點(diǎn)使其成為模型蛋白，為研究蛋白質(zhì)與藥物相互作用時(shí)的構(gòu)象變化和局部微環(huán)境變化提供了便利［13－15］。藥物與血清白蛋白的強(qiáng)結(jié)合導(dǎo)致血漿中游離藥物的利用率低，而弱結(jié)合則導(dǎo)致藥物分布較少［16］，因此藥物對(duì)血漿白蛋白的親和力將直接決定可在游離狀態(tài)下用于治療的藥物量［3］。

熒光光譜法是研究藥物和HSA相互作用的方法之一，可得到結(jié)合常數(shù)及藥物引起的HSA的結(jié)構(gòu)變化等信息［17－18］。表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)是一種用于單分子檢測和界面分析等的分子振動(dòng)光譜，對(duì)研究分子間的相互作用非常靈敏，可提供分子構(gòu)型和化學(xué)鍵變化方面的信息［19－20］，也可以解釋藥物與血漿或血清白蛋白之間相互作用的機(jī)制。在非常低的藥物濃度下，SERS的排他性和靈敏的檢測能力使其成為血漿或血清白蛋白藥物敏感領(lǐng)域中一種有吸引力的工具［21－22］。

本文利用多種光譜技術(shù)討論了OC與HSA相互作用的性質(zhì)，包括相互作用結(jié)合力和子域微環(huán)境的變化，同時(shí)對(duì)結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了評(píng)估。OC－HSA相互作用的有關(guān)信息不僅有利于藥物設(shè)計(jì)和疾病治療，也可為藥物與生物大分子相互作用機(jī)制的研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

UItra－55場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，德國Carl zeiss NTS GmbH）；UV－2450紫外可見光譜儀（日本島津）；雷尼紹拉曼光譜儀（英國雷尼紹），選用633 nm激光器；F－7000熒光光度計(jì)（日本日立）。

HSA用Tris－HCl緩沖液（pH 7.4，0.05 mol/L）配制成1.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，OC用50%無水乙醇/Tris－HCl溶液配制成1.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備液；氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸三鈉（Na3－Cit）及以上試劑均為分析純，購于上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 紫外可見吸收光譜

將HSA溶液濃度固定為1.0×10-5mol/L，控制HSA與OC的濃度比，將其混合液恒溫水浴30 min，掃描波長范圍為200～800 nm的紫外可見吸收光譜。

1.3 熒光光譜

取500μL HSA溶液和不同濃度的OC溶液加至10 mL比色管中，用Tris－HCl緩沖溶液定容，然后置于298 K（303 K或310 K）恒溫水浴30 min。熒光光譜參數(shù)設(shè)定：激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長280 nm，記錄發(fā)射波長范圍230～500 nm的光譜；同步熒光光譜參數(shù)設(shè)定：固定Δλ（Δλ=λemλex）為15 nm和60 nm，掃描熒光光譜。

1.4 金納米顆粒（AuNPs）的制備

參考并改進(jìn)了P.C.Lee法［23］制備AuNPs。首先配制100 mL HAuCl4（1.5 mol/L）和50 mL檸檬酸鈉（1%）溶液；然后取50 mL HAuCl4溶液于燒瓶，采用油浴加熱沸騰后迅速加入5 mL檸檬酸鈉溶液，待溶液變?yōu)榫萍t色后繼續(xù)加熱15 min；最后持續(xù)攪拌冷卻至室溫，置4℃冷藏備用。

1.5 表面增強(qiáng)拉曼光譜

將OC固體置于干燥的玻片上進(jìn)行普通拉曼光譜（NRS）測試。將HSA與OC的混合液與等體積AuNPs混合進(jìn)行SERS測定。選用633 nm的激光器，掃描范圍為350～2 000 nm，曝光時(shí)間為10 s，累計(jì)測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米顆粒的表征

AuNPs的SEM圖如圖1A所示，AuNPs呈尺寸約50 nm的小球狀，大小及分布均勻。圖1B為AuNPs的紫外光譜圖，其在520 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［24］；加入OC后，吸收峰紅移至603 nm，說明OC的附著使AuNPs的偶極矩增大，同時(shí)最大吸收峰的峰強(qiáng)降低；再加入HSA溶液，體系的最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移，最大吸附峰強(qiáng)度進(jìn)一步降低。說明與HSA的相互作用使OC整個(gè)電子共軛體系的能量發(fā)生改變，并引起光譜變化。

圖1 金納米溶膠的SEM圖（A）及室溫下金納米溶膠的紫外光譜圖（B）Fig.1 SEM image（A）and UV－Vis spectra（B）of AuNPs

2.2 OC與HSA作用的紫外可見吸收光譜

HSA色氨酸和酪氨酸殘基中的芳雜環(huán)發(fā)生n－π*和π－π*電子躍遷，使得HSA在280 nm處有吸收峰［25］。如圖2所示，HSA的吸收峰強(qiáng)度隨OC濃度的增加逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)為增色效應(yīng)。由于已消除了藥物的吸收作用，因此吸收強(qiáng)度的提高可能歸因于藥物與蛋白質(zhì)之間形成的基態(tài)復(fù)合物［26］。結(jié)果表明，OC和HSA的相互作用會(huì)影響蛋白質(zhì)的微環(huán)境和基態(tài)復(fù)合物（OCHSA）的形成，使蛋白質(zhì)肽鏈伸展，內(nèi)部氨基酸殘基的微環(huán)境極性及疏水性產(chǎn)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步改變。

圖2 室溫下OC－HSA的紫外可見吸收光譜圖Fig.2 UV－Vis spectra of OC－HSA system T=298 K，c（HSA）=1×10-5 mol/L，c（OC）=0，0.25，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9（×10-5）mol/L for curves 1 to 12

2.3 OC與HSA作用的熒光光譜

在天然構(gòu)象中，HSA結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基可以產(chǎn)生內(nèi)源熒光，其中產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度的是色氨酸殘基（Trp）。因此，HSA結(jié)構(gòu)域IIA中僅包含一個(gè)Trp殘基（Trp214）的獨(dú)特性質(zhì)可以作為研究該結(jié)構(gòu)域中局部微環(huán)境變化和蛋白質(zhì)藥物結(jié)合特性的內(nèi)在探針。如圖3所示，不同溫度下HSA的熒光強(qiáng)度隨著OC濃度的增大而變大，并伴隨著明顯的藍(lán)移。通常認(rèn)為熒光發(fā)射的藍(lán)移意味著熒光團(tuán)周圍的環(huán)境變得更加疏水，而熒光發(fā)射的紅移意味著熒光團(tuán)的暴露，周圍的環(huán)境變得更加親水［10，27－28］。圖3結(jié)果表明OC分子可能結(jié)合在亞結(jié)構(gòu)域IIA中，使部分二級(jí)結(jié)構(gòu)打開，暴露HSA的疏水腔，從而使蛋白質(zhì)的微環(huán)境比其天然狀態(tài)更具疏水性。此外，Trp214殘基微環(huán)境的變化表明HSA與藥物結(jié)合后可能形成更緊湊的結(jié)構(gòu)。

圖3 HSA與不同濃度OC在不同溫度下相互作用的熒光光譜Fig.3 The fluorescence spectra of different concentrations of HSA with OC at different temperatures

2.4 OC與HSA作用的同步熒光光譜

通過同步熒光法選取合適的波長差使重疊的峰分開，從而判斷蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的極性和微環(huán)境變化。Δλ=60 nm表示色氨酸殘基的熒光光譜，Δλ=15 nm代表酪氨酸殘基的熒光光譜［29］。如圖4A所示，隨著OC濃度的增大，最大發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并表現(xiàn)為藍(lán)移，表明色氨酸殘基的外環(huán)境極性減小，疏水性增大，該結(jié)論與從紫外可見吸收光譜以及熒光光譜中獲得的結(jié)論非常吻合。而圖4B光譜圖的峰形未發(fā)生改變，說明酪氨酸殘基的外環(huán)境未發(fā)生顯著改變。

圖4 OC－HSA體系的同步熒光光譜圖Fig.4 Synchronous fluorimetry emission spectra of HSA upon addition of different concentrations OC

2.5 OC與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)

假設(shè)蛋白質(zhì)與藥物作用過程中存在單一結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)熒光增強(qiáng)方程［30-31］：

式中：F0為HSA的熒光強(qiáng)度；F為藥物結(jié)合后的熒光強(qiáng)度；F∞為藥物結(jié)合達(dá)飽和的熒光強(qiáng)度；Q為藥物濃度；K為結(jié)合常數(shù)。以1/ΔF（y）對(duì)1/Q（x）作圖（圖5），直線斜率的倒數(shù)值即為K。OC－HSA體系熒光增強(qiáng)的雙倒數(shù)圖具有明顯的線性，說明溫度對(duì)兩者間作用的K影響較小，且在不同溫度下K值均較大（表1），說明兩者結(jié)合穩(wěn)定。

表1 不同溫度下OC與HSA的結(jié)合常數(shù)Table 1 Binding constants of OC－HSA at different temperatures

圖5 OC－HSA體系在不同溫度下的熒光增強(qiáng)曲線Fig.5 Fluorescence enhancement curves for OCHSA system at different temperatures

2.6 OC與HSA的鍵和模式

根據(jù)Gibbs－Helmholtz方程［31］可以推斷出配體與生物大分子之間相互作用的方式：

式中：K表示平衡常數(shù)；T表示溫度；ΔH表示焓變；R表示摩爾氣體常數(shù)；ΔG表示吉布斯自由能；ΔS表示熵變。焓變?chǔ)在溫度變化不大的條件下可作為常數(shù)。由表2可知，將一定量的OC加入到HSA溶液中時(shí)可獲得負(fù)的ΔH和正的ΔS，表明OC與HSA間存在靜電和疏水作用力［32］。但是，靜電力通常伴隨著接近零的ΔH值。本研究中獲得的ΔH為負(fù)值表明HSA與OC之間沒有靜電作用力。另一方面，ΔH為負(fù)可歸因于范德華力以及OC與HSA極性氨基酸殘基之間的氫鍵［32－33］。因此，疏水力、范德華力以及氫鍵被認(rèn)為是穩(wěn)定HSA－OC復(fù)合物的主要作用力［28，32］。

表2 不同溫度下OC與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of OC－HSA at different temperatures

2.7 OC的表面增強(qiáng)拉曼光譜

如圖6所示，AuNPs對(duì)OC的拉曼信號(hào)有明顯的增強(qiáng)作用。參考文獻(xiàn)［34－37］并結(jié)合OC理論拉曼光譜（Theoreticala）對(duì)OC分子的譜峰進(jìn)行歸屬。其NRS光譜中598 cm-1處為C—N—C的面外彎曲振動(dòng)；715 cm-1處的峰由甲氧基伸縮振動(dòng)引起；1 331 cm-1處由C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)引起。在OC的SERS光譜中，598、682、792 cm-1處的面外振動(dòng)模式峰未增強(qiáng)，甚至消失，而面內(nèi)彎曲振動(dòng)（1 158 cm-1）和苯環(huán)面內(nèi)變形振動(dòng)（1 579 cm-1）顯著增強(qiáng)。由表面選擇定則可知：垂直方向的振動(dòng)模式被顯著增強(qiáng)，平行基底表面的振動(dòng)模式增強(qiáng)較小，表明OC以垂直方式在基底表面吸附。此外，983 cm-1處的SERS譜峰對(duì)應(yīng)于C—O—C的伸縮振動(dòng)，該振動(dòng)在NRS中是一個(gè)弱峰，而在SERS譜圖中明顯增強(qiáng)，再次表明分子以垂直方式結(jié)合于基底表面。OC的SERS譜圖中位于1 158 cm-1處的C—O—H剪式振動(dòng)模式增強(qiáng)，表明OC可能以—O-形式吸附在AuNPs表面。圖6中苯環(huán)骨架振動(dòng)特征峰出峰特別明顯，原因在于，OC分子中的苯環(huán)是一個(gè)大π鍵的共軛體系，與基底結(jié)合時(shí)周圍的π電子發(fā)生化學(xué)吸附，受苯環(huán)π電子的影響，OC分子牢牢地吸附在AuNPs表面，從而增大了拉曼信號(hào)。

圖6 OC的SERS光譜Fig.6 Surface-enhance Raman spectroscopy of OC

2.8 OC與HSA作用的表面增強(qiáng)拉曼光譜

圖7顯示，HSA在AuNPs基底中的振動(dòng)峰強(qiáng)度不大，OC－HSA相互作用的結(jié)合方式和空間取向可通過與HSA識(shí)別前后OC分子SERS譜圖的變化進(jìn)行分析。OC與HSA相互作用后的光譜峰強(qiáng)度顯著降低，信噪比較差，說明兩者發(fā)生了強(qiáng)烈的相互作用。在OC的SERS譜圖中，存在甲氧基伸縮振動(dòng)峰（712 cm-1）和983 cm-1處C—O—C的伸縮振動(dòng)（圖6），而與HSA作用后，這兩個(gè)振動(dòng)峰的相對(duì)強(qiáng)度降低，表明OC分子可能以甲氧基團(tuán)嵌入到HSA的疏水位點(diǎn)中。此外，OC－HSA的C—H面外彎曲振動(dòng)（695 cm-1和827 cm-1）和骨架伸縮振動(dòng)峰以及面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰均有所增強(qiáng)，表明與HSA結(jié)合后，表面OC在AuNPs上的空間取向發(fā)生了變化。但C—O—H剪式振動(dòng)峰（1 164 cm-1）被顯著增強(qiáng)，表明OC與HSA作用前后，以—O-形式吸附在AuNPs表面，吸附方式由垂直吸附轉(zhuǎn)變?yōu)閮A斜吸附。

3 結(jié) 論

本文在模擬生理?xiàng)l件下通過多種光譜法對(duì)OC與HSA的相互作用進(jìn)行研究，以了解藥物結(jié)合作用誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)微環(huán)境變化。熒光光譜結(jié)果表明，OC分子能夠進(jìn)入色氨酸殘基附近的亞結(jié)構(gòu)域IIA疏水空腔內(nèi)部。通過過程熱力學(xué)參數(shù)研究和分析，得出OC與HSA分子之間的作用力主要是氫鍵、范德華力和疏水作用力。這些相互作用導(dǎo)致OC－HSA復(fù)合物的形成，使蛋白質(zhì)的局部微環(huán)境比其原生狀態(tài)更疏水。最后以AuNPs作為增強(qiáng)基底，通過比較與HSA識(shí)別前后OC分子的SERS譜圖的變化情況，推斷OC分子以甲氧基作用于HSA的疏水腔中。該研究為進(jìn)一步探索OC在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、排泄，以及藥用科學(xué)性、合理性的發(fā)展等提供了一定的理論依據(jù)，對(duì)于闡明OC作用機(jī)理，揭示藥物藥效的實(shí)質(zhì)以及生物體系內(nèi)主客體識(shí)別的化學(xué)本質(zhì)具有重要意義。