超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿

薛 霞，丁 一，公丕學(xué)，盧蘭香，王 駿，張艷俠，武傳香，宿書芳，魏莉莉，劉艷明，胡 梅

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心 山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

蜂蜜所含的單糖無需消化即可被人體吸收，對婦、幼特別是老人具有良好的保健作用，因而被稱為“老人的牛奶”［1－2］。近年來，受蜂蜜產(chǎn)量、價(jià)格及檢測標(biāo)準(zhǔn)滯后等因素的影響，不少商販采用各種摻假手段生產(chǎn)低質(zhì)量蜂蜜，甚至假蜂蜜，以賺取高額利潤。摻假蜂蜜極大損害了蜂農(nóng)、消費(fèi)者和正規(guī)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的利益，嚴(yán)重影響了蜂蜜的市場秩序和出口貿(mào)易。為提高蜂農(nóng)的生產(chǎn)積極性，維護(hù)蜂蜜市場秩序，促進(jìn)我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，建立一套靈敏、高效、準(zhǔn)確的蜂蜜內(nèi)源性成分的分析方法，對蜂蜜摻偽鑒別具有重要意義與價(jià)值。

乙酰膽堿是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)功能。膽堿是卵磷脂和鞘磷脂的組成部分，同時(shí)又是乙酰膽堿的前體［3－4］。蜂蜜中的乙酰膽堿無需經(jīng)過體內(nèi)合成即可直接被人體神經(jīng)細(xì)胞吸收和利用；蜂蜜中大量的膽堿在人體內(nèi)發(fā)生生化反應(yīng)，還可合成具有生理活性的乙酰膽堿。因此，經(jīng)常服用蜂蜜可以提高腦內(nèi)乙酰膽堿的含量，從而促進(jìn)、激活腦神經(jīng)傳導(dǎo)功能，提高信息傳遞速度，增強(qiáng)大腦記憶能力。此外，蜂蜜中的乙酰膽堿進(jìn)入人體后，還可對副交感神經(jīng)發(fā)生作用，促進(jìn)胃腸蠕動。

關(guān)于膽堿和乙酰膽堿含量的測定，報(bào)道較多的方法有比色法［5－6］、毛細(xì)管電泳法［7］、離子色譜法［8－9］、液相色譜法［10－13］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［14－20］等。傳統(tǒng)的比色法操作繁瑣、分析時(shí)間長，而且前處理易造成樣品損失，選擇性差，干擾因素多。毛細(xì)管電泳法的重現(xiàn)性較差。離子色譜法普及性不高、通用性較差；液相色譜法采用的紫外檢測器、電導(dǎo)檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器均為通用型檢測器，靈敏度不高。液相色譜－質(zhì)譜法具有分離效率高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為復(fù)雜基質(zhì)樣本中痕量或微量目標(biāo)物的重要檢測手段。乙酰膽堿的測定文獻(xiàn)大多集中在血漿、鼠腦等生物樣本［6，12，18－19］，而膽堿的現(xiàn)有文獻(xiàn)多為嬰幼兒配方乳粉、乳粉和特殊醫(yī)學(xué)配方食品的研究［5，15－17，20］。目前尚未見蜂蜜中膽堿與乙酰膽堿同時(shí)測定的文獻(xiàn)報(bào)道。

本文建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿含量的分析方法，方法操作簡單、專屬性好、準(zhǔn)確性高，已成功應(yīng)用于實(shí)際蜂蜜樣品中膽堿和乙酰膽堿的測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AB SCIEX Triple Quad 5500三重四極桿質(zhì)譜分析儀（配有電噴霧電離源ESI，美國SCIEX公司）；3－18K臺式高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；BT 125D電子天平（德國Sartorius公司）；MS3型旋渦混合器（德國IKA公司）；SB－800DTD超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm，美國Waters公司）。

氯化膽堿（CAS號：67－48－1，純度97.0%）、氯化乙酰膽堿（CAS號：60－31－1，純度99.7%）標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸銨、乙酸（色譜純，美國Fluka公司）；高氯酸（分析純，天津政成化學(xué)制品有限公司）；鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 樣品采集

天然成熟蜂蜜均購自當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)，并于4℃冰箱中保存。其它蜂蜜和糖漿購自網(wǎng)購平臺。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于25 mL比色管中，加入10 mL水渦旋混勻，超聲15 min，取出恢復(fù)至室溫后用乙腈定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確移取1.0 mL提取溶液于50 mL容量瓶中，用乙腈－水（體積比8∶2）稀釋并定容至刻度，混合均勻后，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，上機(jī)測定。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件色譜柱：BEH HILIC（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：A相為10 mmol/L乙酸銨（含0.1%乙酸）溶液，B相為乙腈；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2μL，流速：0.35 mL/min。梯度洗脫程序：0～3.5 min（90%～60%B），3.5～4.5 min（60%～40%B），4.5～5.5 min（40%B），5.5～5.6 min（40%～90%B），5.6～8.0 min（90%B）。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；掃描方式：正離子模式掃描；電噴霧電壓：5 500 V；霧化氣壓力：50 psi；氣簾氣壓力：40 psi；輔助氣壓力：50 psi；碰撞氣壓力：8 psi；離子源溫度：550℃。母離子、子離子、去簇電壓、駐留時(shí)間及碰撞能量見表1。

表1 乙酰膽堿和膽堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of acetylcholine and choline

1.5 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

分別測定純?nèi)軇┡c樣品提取液中目標(biāo)物的峰面積響應(yīng)值，以二者的相對比值來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect）。Matrix effect factor（ME，%）=（A－B）/A×100，其中ME為基質(zhì)效應(yīng)因子，A為純?nèi)軇┲心繕?biāo)物的峰面積響應(yīng)值，B為樣品提取液中目標(biāo)物的峰面積響應(yīng)值。ME絕對值越大基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

膽堿和乙酰膽堿極性較強(qiáng)，在反相色譜柱上保留弱，峰形拖尾嚴(yán)重。采用HSS T3和Xbridge C18兩種常用于極性化合物的反相色譜柱進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)：即使流動相中有機(jī)相的比例降為5%，膽堿和乙酰膽堿在兩種反相柱上的保留時(shí)間仍不足1 min；文獻(xiàn)［11］采用添加離子對試劑的方法增強(qiáng)膽堿和乙酰膽堿在反相色譜柱上的保留，但離子對試劑與質(zhì)譜兼容性差，易對質(zhì)譜造成污染。親水作用色譜（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）能為強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性的化合物提供合適的保留，流動相中高比例有機(jī)相的使用也有利于提高質(zhì)譜的離子化效率［21］。本文采用Waters公司ACQUITY UPLCTMBEH HILIC色譜柱進(jìn)行分離。

在HILIC流動相中，常通過加入緩沖鹽改善化合物的峰形。比較了流動相中不含乙酸銨及含5 mmol/L和10 mmol/L乙酸銨時(shí)對目標(biāo)物分析的影響。結(jié)果表明：未加入乙酸銨時(shí)，色譜峰分叉；隨著乙酸銨濃度的增加，峰形逐漸變好，但乙酸銨為10 mmol/L時(shí)色譜峰前伸依然明顯。在10 mmol/L乙酸銨溶液中加入0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸后，膽堿和乙酰膽堿的色譜峰峰形對稱，且響應(yīng)值明顯提高。因此，最終采用10 mmol/L乙酸銨（含0.1%乙酸）和乙腈作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

膽堿和乙酰膽堿的結(jié)構(gòu)中均含有季銨基團(tuán)，易被電離成正離子。將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，在全掃描模式下，獲得化合物的分子離子峰，結(jié)合化合物分子式，選擇分子離子峰均為［M+H］+；在產(chǎn)物離子掃描模式下，以各化合物的分子離子峰為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，獲得碎片離子，選擇兩對豐度較強(qiáng)，基質(zhì)干擾較小的離子為子離子。在MRM模式下，對去簇電壓、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1水解必要性考察膽堿是強(qiáng)有機(jī)堿性化合物，以游離態(tài)膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂、鞘磷脂等形式廣泛存在于生物機(jī)體中。測定嬰幼兒配方乳粉、乳粉等基質(zhì)中膽堿時(shí)通常采用恒溫水解的方式釋放結(jié)合態(tài)，測定總膽堿含量［5，15，20，22］。結(jié)合文獻(xiàn)，本研究考察了鹽酸水解方法對蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿提取效率的影響。以同一個(gè)天然成熟的洋槐蜜樣本進(jìn)行考察。A組樣品按照“1.3”進(jìn)行處理，B組樣品的制備步驟為：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入10 mL 1.0 mol/L HCl渦旋混合均勻后，在70℃下水浴水解3 h，水解后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至25 mL比色管或容量瓶中，用水定容至刻度。最后用乙腈－水（體積比8∶2）稀釋50倍，過膜上機(jī)測定。每組樣品均平行測定3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A組乙酰膽堿的含量分別為3.86、3.75、3.68 mg/kg；膽堿的含量分別為27.50、28.62、28.49 mg/kg。B組乙酰膽堿的含量分別為0.26、0.31、0.24 mg/kg；膽堿的含量分別為28.75、29.56、29.04 mg/kg。由此可見水解過程中乙酰膽堿損失嚴(yán)重，膽堿含量變化不明顯。原因可能是蜂蜜中的膽堿主要以游離態(tài)存在，結(jié)合態(tài)含量很低，且其在酸性條件下熱穩(wěn)定性較好，因此水解前后含量變化不大。乙酰膽堿是膽堿和乙酸形成的酯，其最穩(wěn)定的pH值為3.8～4.5［23］，在加熱、強(qiáng)酸性條件下可能發(fā)生水解反應(yīng)，故損失明顯。而實(shí)驗(yàn)所用蜂蜜樣品中乙酰膽堿含量約為膽堿含量的十分之一，即便乙酰膽堿水解產(chǎn)生了部分膽堿，膽堿含量的增加也不顯著。因此，本研究未進(jìn)行水解反應(yīng)直接進(jìn)行測定。

2.3.2提取溶劑的選擇膽堿和乙酰膽堿均易溶于水，蜂蜜中糖含量較高，樣本粘稠，水系溶劑能使樣品均勻分散，更有利于目標(biāo)物的提取。生物樣本中膽堿和乙酰膽堿的測定常采用高氯酸［10］或乙腈［18］進(jìn)行蛋白沉淀。本實(shí)驗(yàn)分別考察了0.4 mol/L高氯酸溶液、水－乙腈溶液（體積比2∶3）、0.1%甲酸水－乙腈（體積比2∶3）溶液和純水4種提取溶劑對提取效率的影響。向空白果葡糖漿（F55）基質(zhì)中加入1.0 mg/kg和10.0 mg/kg的乙酰膽堿和膽堿標(biāo)準(zhǔn)品，分別用上述提取溶劑進(jìn)行提取，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，用0.4 mol/L高氯酸溶液提取后膽堿的回收率為137%，純水提取后其回收率不足85%，用0.1%甲酸水－乙腈（體積比2∶3）溶液提取后，膽堿的基質(zhì)效應(yīng)明顯（23.1%）。綜合以上因素，最終選擇水－乙腈（體積比2∶3）溶液作為提取溶劑，此時(shí)膽堿和乙酰膽堿的回收率分別為102%和91.8%。

2.3.3凈化條件的考察為減少蜂蜜中大量的糖類物質(zhì)對儀器的污染，需對樣本進(jìn)行凈化。陳舒舒等［24］的研究表明，N-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）可有效吸附蜂蜜中的糖類及有機(jī)色素等雜質(zhì)。本文考察了PSA對蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿的凈化效果。蜂蜜用水溶解后，以乙腈定容至刻度，混合均勻，加入固體氯化鈉使乙腈與水分層。移取1 mL乙腈層，加入150 mg無水硫酸鎂，再加入25 mg PSA渦旋混合、離心后過濾，上機(jī)測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙酰膽堿的回收率僅為17.5%，膽堿的回收率為零。這是因?yàn)槟憠A和乙酰膽堿在水中溶解性好，無法萃取到乙腈層中。

為降低糖分對儀器的污染，采用乙腈－水（體積比8∶2）對糖漿和蜂蜜的提取溶液進(jìn)行稀釋。發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)為50時(shí)，回收率及基質(zhì)效應(yīng)均滿足定量要求。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

進(jìn)一步對洋槐蜜和果葡糖漿（F55）中2個(gè)目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，結(jié)果顯示：水－乙腈（2∶3）作為提取溶劑時(shí)，樣品中膽堿和乙酰膽堿的ME均小于10%，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，滿足定量需求。由于蜂蜜中大都含有膽堿和乙酰膽堿，很難得到空白基質(zhì)。本方法采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線定量，減少了匹配相同空白基質(zhì)的難操作性和不同空白樣品匹配的差異性。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性關(guān)系、檢出限及定量下限將質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、2.5、5 ng/mL和0.5、1、5、10、25、50 ng/mL的乙酰膽堿和膽堿混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按“1.4”條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，各化合物的定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在0.05～5 ng/mL和0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)，乙酰膽堿和膽堿線性關(guān)系良好，線性方程分別為：Y=2.223 04×106X+2 978.314 58和Y=5.776 37×105X+1.777 38×105，相關(guān)系數(shù)均（r2）大于0.99。以峰高3倍信噪比處對應(yīng)的濃度作為方法檢出限（LOD）；以峰高10倍信噪比處對應(yīng)的濃度作為方法定量下限（LOQ）。乙酰膽堿的LOD和LOQ分別為0.05、0.1 mg/kg；膽堿的LOD和LOQ分別為0.5、1.0 mg/kg。果葡糖漿（F55）LOQ水平的加標(biāo)譜圖見圖1。

圖1 果葡糖漿（F55）中乙酰膽堿（A）和膽堿（B）定量下限加標(biāo)水平的色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of showing the LOQs for acetylcholine（A）and choline（B）spiked in high fructose syrup（F55）

2.5.2回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在果葡糖漿（F55）樣品中添加一定量的乙酰膽堿和膽堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩者的濃度水平分別為0.1、1、5 mg/kg和1、10、50 mg/kg；洋槐蜂蜜中乙酰膽堿和膽堿的加標(biāo)濃度水平分別為5、50 mg/kg，平行測定6次，計(jì)算方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果見表2。乙酰膽堿和膽堿在糖漿和洋槐蜂蜜中的回收率為97.3%～103%，RSD均不大于5.1%，結(jié)果滿足GB/T 27404－2008［25］對回收率和精密度的要求。

表2 乙酰膽堿和膽堿的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of acetylcholine and choline（n=6）

2.6 實(shí)際樣品應(yīng)用

利用本方法對天然成熟的真蜂蜜38批次（洋槐蜂蜜19批次、棗花蜂蜜10批次、荊條蜂蜜9批次），網(wǎng)購的廉價(jià)蜂蜜32批次（洋槐蜂蜜12批次、棗花蜂蜜10批次、荊條蜂蜜10批次），果葡糖漿（F55）、果葡糖漿（F42）、甜菜糖漿、大米糖漿等10批次糖漿類樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，糖漿中乙酰膽堿和膽堿均未檢出，其余不同種類的天然成熟蜂蜜、網(wǎng)購廉價(jià)蜂蜜的檢測結(jié)果見表3。洋槐蜜的色譜圖見圖2。

圖2 洋槐蜜樣品中乙酰膽堿（A）和膽堿（B）的色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of acetylcholine（A）and choline（B）in an acacia honey sample

表3 蜂蜜中乙酰膽堿和膽堿的含量（n=3）Table 3 Determination of acetylcholine and choline in honey（n=3）

由表3可知，天然成熟洋槐蜜中膽堿含量明顯高于棗花蜜和荊條蜜，乙酰膽堿含量也高于棗花蜜，與荊條蜜相當(dāng)。迄今為止，已經(jīng)證實(shí)在30多科50多種高等植物體內(nèi)存在乙酰膽堿［23］，而乙酰膽堿是膽堿與乙酸形成的酯，因此不同蜂蜜中膽堿與乙酰膽堿的含量差異可能與花的種類及花期有較大聯(lián)系。天然成熟蜜中的乙酰膽堿和膽堿含量明顯高于廉價(jià)蜂蜜，原因可能與蜂蜜中摻入糖漿有關(guān)。

3 結(jié) 論

本文建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿的快速分析方法。樣品用水－乙腈（2∶3）提取，適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測定，方法操作簡單、專屬性好、準(zhǔn)確性高。膽堿和乙酰膽堿作為內(nèi)源性物質(zhì)，其含量水平可為天然成熟蜂蜜、廉價(jià)蜂蜜和糖漿的區(qū)分提供幫助。該方法對規(guī)范蜂產(chǎn)品市場、保障消費(fèi)者合法權(quán)益以及促進(jìn)我國蜂產(chǎn)品事業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。