基于UPLC－Q－TOF MS的廣佛手指紋圖譜建立及炮制前后成分差異分析

吳學峰，周 熙，黃曉蘭，吳惠勤，謝 斌*

（1.廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東省中藥質量安全工程技術研究中心，廣東 廣州 510070；2.廣州海關技術中心，廣東 廣州 510623）

廣佛手為蕓香科柑橘屬植物佛手Citr us medicaL.var.sarcod act ylisSwingle的干燥果實，切片曬干可得生廣佛手，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效［1］。廣佛手主產于廣東高要、德慶等地，作為傳統(tǒng)南藥，近年來已被《廣東省嶺南中藥材保護條例》收錄為第一批受保護的嶺南中藥材。制廣佛手是嶺南特色飲片，由生廣佛手炮制晾干制得，在廣東地區(qū)的臨床應用中，制廣佛手較生廣佛手更為常用。中藥炮制后，化學成分往往會發(fā)生變化，繼而改變藥材的性味和功效，因此揭示廣佛手炮制前后化學成分的變化規(guī)律顯得尤為重要。目前，生、制佛手的化學成分差異研究主要集中在揮發(fā)性成分，如羅朵生等［2］、汪金玉等［3］采用氣相色譜－質譜（GC－MS）技術研究佛手炮制前后的揮發(fā)油成分差異，發(fā)現經炮制后，佛手中的飽和化合物含量增加，不飽和化合物含量降低。而難揮發(fā)性成分的變化規(guī)律研究較薄弱，僅汪金玉等［4］研究發(fā)現廣佛手炮制前后5-羥甲基糠醛的含量增加明顯，揭示炮制中發(fā)生了美拉德反應，同時橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的含量也發(fā)生變化。

主成分分析（PCA）與正交偏最小二乘法判別分析（OPLS－DA）等化學模式識別方法是區(qū)分藥材、篩選中藥差異性成分和尋找化學標志物的重要方法，在中藥質量控制、組效關系研究中具有重要意義［5］。中藥指紋圖譜是中藥真?zhèn)舞b定、質量一致性和穩(wěn)定性評價的可行性方法［6－7］。李金玉等［8］收集廣東高要不同收期的20個樣品建立了佛手的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，選定橙皮苷與5，7-二甲氧基香豆素為參考成分，發(fā)現相同采摘期佛手的化學成分及含量存在差異；鄭振興等［9］用31批佛手建立HPLC指紋圖譜，可用于鑒別佛手真?zhèn)闻c區(qū)分同科同屬植物。但佛手的HPLC指紋圖譜僅提供其化學成分及色譜峰保留時間信息，缺乏色譜峰的定性數據，又因紫外檢測器吸收波長的選擇性，難以較全面表征佛手復雜的化學成分。超高效液相色譜－四極桿串聯飛行時間質譜（UPLC－Q－TOF MS）具有高靈敏度、高分辨率及強大的定性表征能力，可彌補HPLC的不足，因此采用UPLC－Q－TOF MS建立中藥及中成藥指紋圖譜具有良好的發(fā)展前景。

本研究采用UPLC－Q－TOF MS建立生、制廣佛手的指紋圖譜，所得指紋圖譜不僅反映了廣佛手的難揮發(fā)性化學組成，還能提供色譜峰的定性數據，可較全面地表征生、制廣佛手的化學成分，并可用于廣佛手真?zhèn)舞b別。在此基礎上，結合數理統(tǒng)計方法，分析生廣佛手經炮制后難揮發(fā)性成分的變化并找出顯著性差異成分，對于揭示其炮制內涵和開展生、制廣佛手的質量控制具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與樣品

5，7-二甲基香豆素、佛手苷內酯、香葉木苷、香葉木素、諾米林、黃柏酮、6，7-二甲氧基香豆素、棕櫚酸、原兒茶酸、圣草次苷、佛手酚、α-亞麻酸、油酸、橙皮素購于成都瑞芬思生物科技有限公司；水合氧化前胡素購于上海詩丹德生物技術有限公司；阿魏酸、檸檬苦素、橙皮苷、蘆丁、歐前胡素購于廣州分析測試中心科力技術開發(fā)公司；壬二酸購于成都格雷西亞化學技術有限公司；蘋果酸購于常州新華活性研究所。所有對照品純度均大于98%。

甲醇、乙腈（色譜純）購自德國Merck公司；蒸餾水購自中國香港屈臣氏公司；甲酸（色譜純）購自美國Fisher Scientific公司；乙酸銨（色譜純）購自美國Sigma－Aldrich公司。

11批次生廣佛手產地均為廣東肇慶，其中10批次購自佛山市大瀝鎮(zhèn)黃芪聯益貿易部，1批次購自廣州市越秀區(qū)大參林藥房，分別編號為SG1～SG11。稱取各批次生廣佛手約50 g，充分潤濕后用紗布包裹置于蒸鍋中，待水沸騰后轉小火，繼續(xù)炮制2.5 h，自然降溫后于50℃恒溫干燥箱中烘干［3］，即得制廣佛手樣品，分別編號為ZG1～ZG11。樣品信息見表1。

表1 廣佛手樣品編號和詳細信息Table 1 Fingered Citron sample number and details

1.2儀器

1290液相色譜－G6540系列四極桿－飛行時間質譜聯用儀，配有電噴霧離子源（ESI），MassHunter數據采集系統(tǒng)（美國安捷倫科技有限公司）；TP－114型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；JP－060超聲波清洗機（深圳市潔盟七夕設備有限公司）；H1850R離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DH9－9071A電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1供試品制備將樣品粉碎后過3號篩（孔徑0.355 mm），精密稱取1.0 g樣品置于50 mL錐形瓶中，加入10 mL無水甲醇，搖勻，稱定重量，超聲1 h后取出，冷卻至室溫。稱定重量并用甲醇補足失重，搖勻，取上層液體以14 000 r/min離心10 min，上清液即為供試品溶液。質控樣品（QC）由各樣品各取100μL混合制得。

1.3.2對照品溶液制備分別稱取各對照品適量溶于甲醇，制得質量濃度約為1 000 mg/L的單一對照品溶液。臨用前取各對照品儲備液適量并混合，用甲醇稀釋至10 mg/L，即得混合對照品溶液。

1.3.3色譜條件色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC－C18柱（3.0 mm×150 mm×2.7μm）；流動相為：A（0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨水溶液）－B（乙腈）。梯度洗脫程序：0～5 min，95%～90%A；5～10 min，90%～88%A；10～35 min，88%～80%A；35～50 min，80%～70%A；50～65 min，70%～60%A；65～70 min，60%～30%A；70～78 min，30%～10%A；78～81 min，10%～2%A；81～84 min，2%A；84～84.1 min，2%～95%A；84.1～88 min，95%A。流速：0.5 mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測時間：88 min。

1.3.4質譜條件毛細管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：1 000 V；毛細管出口電壓：150 V；錐孔電壓：65 V；干燥氣（氮氣）溫度：300℃；干燥氣（氮氣）流速：8 L/min；鞘氣（氮氣）溫度：350℃；鞘氣（氮氣）流速：12 L/min；碰撞能量梯度：10、20、40 eV，一級質譜掃描范圍：m/z100～1 000，二級質譜掃描范圍：m/z50～1 000。

2 結果與討論

2.1 UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜的建立

2.1.1方法學考察指標的確定前期研究發(fā)現，負離子模式下檢出成分較正離子模式多［10］，因此本實驗采用ESI源在負離子模式下采集數據。為使建立的指紋圖譜科學、可靠，選擇色譜響應較好且具代表性的活性成分圣草次苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、檸檬苦素和諾米林酸為指標，用于指紋圖譜方法學驗證，驗證內容包括精密度、重復性、穩(wěn)定性。

2.1.2精密度取同一批生廣佛手供試品溶液，連續(xù)進樣6次，計算上述5種選定指標的色譜峰保留時間及峰面積的相對標準偏差（RSD）。結果顯示，所有參考指標保留時間和峰面積的RSD分別為0.010%～0.21%和0.37%～3.3%。將6次采集數據導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”軟件（簡稱相似度評價軟件）進行相似度評價，結果均大于0.99。以上結果表明儀器的精密度良好，符合廣佛手指紋圖譜建立的要求。

2.1.3重復性稱取6份同一批號的生廣佛手，制備6份平行樣品，依次進樣分析，計算選定指標對應色譜峰保留時間及峰面積的RSD。結果顯示，所有參考指標保留時間和峰面積的RSD分別為0.010%～0.19%和0.93%～4.6%。將6次采集數據導入相似度評價軟件進行相似度評價，結果均大于0.99。以上結果表明該方法的重復性良好，符合廣佛手指紋圖譜建立的要求。

2.1.4穩(wěn)定性制備1份樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、18、24 h時進樣分析，記錄色譜圖，并計算選定指標對應色譜峰保留時間及峰面積的RSD。結果顯示，所有參考指標保留時間和峰面積的RSD分別為0.050%～0.17%和3.5%～6.3%。將7次采集數據導入相似度評價軟件進行相似度評價，結果均大于0.99。以上結果表明供試品溶液在24 h內的穩(wěn)定性良好，符合廣佛手指紋圖譜建立的要求。

2.2 生、制廣佛手的化學成分

按照“1.3.3”與“1.3.4”的色譜與質譜條件對標準品溶液、生廣佛手及制廣佛手樣品溶液進行分析，其負離子模式下的總離子流圖見圖1。通過分子離子峰精確質量數、二級譜圖等信息，結合文獻［9－11］與化合物數據庫，對樣品中37個成分進行鑒定，包括：10個黃酮及黃酮苷類、4個香豆素類、12個有機酸類、5個糖苷類、2個檸檬苦素類及4個其它類（見表2）。其中，圣草次苷可抑制氧化應激、炎癥反應及降血脂［12］；檸檬苦素類化合物具有抑制乳腺癌細胞的潛力［13］；橙皮苷為《中國藥典》規(guī)定的廣佛手指標成分［1］，具有抗炎、抗氧化及抗癌功效［14］。

表2 生、制廣佛手化學成分的質譜數據及鑒定結果Table 2 Mass spectrometric data and the identification results of constituents in raw Fingered Citron and processed Fingered Citron

圖1 生廣佛手（A）、制廣佛手（B）甲醇提取物及標準品溶液（C）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of UPLC－Q－TOF MS for methanol extraction of raw Fingered Citron（A），processed Fingered Citron（B）and standard solution（C）

（續(xù)表2）

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1生廣佛手指紋圖譜的建立利用Qualitative Analysis B.07.00軟件對11批生廣佛手的UPLCQ－TOF MS質譜數據進行處理，提取并積分總離子流（TIC）圖，導出色譜峰峰面積、峰高和保留時間等信息，建立相似度評價軟件識別的.txt格式數據文件，導入評價軟件，建立生廣佛手的UPLCQ－TOF MS指紋圖譜（圖2A），并生成對照譜圖（圖2B）。指紋圖譜的相似度結果均大于0.96，表明11批次生廣佛手的相似度較好。相似度評價軟件自動識別出24個共有峰，通過分子離子峰精確質量數、二級譜圖等信息，結合文獻、化合物數據庫與對照品驗證，鑒定出以下19個成分：S1、S2、S3為1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或異構體，S6為金圣草素-6，8-葡萄糖苷，S7為圣草次苷，S8為6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸，S9為3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸，S10為橙皮苷，S11為水合氧化前胡素，S12為橙皮素，S14為3，5，6-三羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮或異構體，S15為檸檬苦素，S17為諾米林酸，S18為3，5，6-三羥基-4′，7-二甲氧基黃酮或異構體，S20為α-亞麻酸，S21為甲氧基-十五烷酸，S22為油酸，S23為棕櫚酸，S24為十八烷酸（見表2）。

圖2 生廣佛手藥材的指紋圖譜（A）與對照指紋圖譜（B）Fig.2 Fingerprint（A）and reference fingerprint（B）of raw Fingered Citron the number denoted were the same as those in Table 2

2.3.2制廣佛手指紋圖譜的建立將11批制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS質譜數據按照“2.3.1”方法操作，建立制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜（圖3A），生成對照譜圖（圖3B），得到相似度均大于0.96，表明11批次制廣佛手的相似度好。制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜中有22個共有峰，通過裂解規(guī)律推斷、數據庫匹配、參考文獻與對照品驗證，鑒定出以下14個成分：Z1為1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或異構體，Z2為3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯，Z3為圣草次苷，Z4為橙皮苷，Z5為水合氧化前胡素，Z9為3，5，6-三羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮或異構體，Z10為檸檬苦素，Z12為諾米林酸，Z13為3，5，6-三羥基-4′，7-二甲氧基黃酮或異構體，Z16為葡萄內酯，Z19為α-亞麻酸，Z20為油酸，Z21為棕櫚酸，Z22為十八烷酸（見表2）。

圖3 制廣佛手藥材的指紋圖譜（A）與對照指紋圖譜（B）Fig.3 Fingerprint（A）and reference fingerprint（B）of processed Fingered Citron the number denoted were the same as those in Table 2

生、制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜中，共檢出成分有11個，分別為：1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或異構體、圣草次苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、3，5，6-三羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮或異構體、檸檬苦素、諾米林酸、α-亞麻酸、油酸、棕櫚酸和十八烷酸。表明廣佛手生品與制品的指紋圖譜較為相似。未同時檢出的成分有7個，分別為：S6（金圣草素-6，8-葡萄糖苷），S8（6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸），S9（3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸），S12（橙皮素），S21（甲氧基-十五烷酸），Z2（3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯）以及Z16（葡萄內酯），可作為輔助鑒定生、制廣佛手的成分。比較發(fā)現，生廣佛手炮制后金圣草素-6，8-葡萄糖苷、6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸、3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸、橙皮素及甲氧基-十五烷酸在制廣佛手中未檢出，而是檢出了3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯與葡萄內酯。其中，橙皮素可抑制黑色素瘤增殖，有抗腫瘤作用［11］，表明生廣佛手炮制后的難揮發(fā)性化學成分發(fā)生變化，繼而改變其功效。

2.4 化學模式識別分析

主成分分析（PCA）通過對高維數據降維，變換出重要的少數變量來反映整個樣品的信息，可以清晰展示數據內的重復性與各組樣本的差異性［14］。正交偏最小二乘法判別分析（OPLS－DA）對數據進行降維處理時引用了回歸模型，可建立各數據與分組的關系，取得各組樣本間的差異信息，還可對樣本的分組進行預測。上述2種方法均可衡量各種成分表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助標志成分的篩選［15］。因此，利用UPLC－Q－TOF MS在正、負模式下采集數據，用SIMCA14.1軟件對生、制廣佛手進行PCA與OPLS－DA分析，研究廣佛手炮制前后難揮發(fā)性成分的差異性。

2.4.1主成分分析將22批廣佛手的數據經安捷倫Profinder 10軟件進行處理，得到保留時間、精確質量數與響應度構成的數據文件，導入SIMCA14.1軟件，在PCA－X模式下進行分析。從得分圖（圖4）看出，質控樣（QC）聚集較好，表明方法穩(wěn)定；制廣佛手（Z）與生廣佛手（S）樣品分別沿t（1）或t（2）軸分開，說明廣佛手炮制前后的化學組成存在差異；購于大參林藥店的生廣佛手與其制品在中心橢圓外，與集中購買的10批次樣品不聚集，說明兩種來源的廣佛手存在差異，也證實了兩者來源不同。

圖4 樣品的PCA-X模式得分圖Fig.4 PCA-X scores of samples

2.4.2正交偏最小二乘法判別分析對生、制廣佛手兩組樣品進行OPLS－DA分析，從得分圖（圖5A）可見，生廣佛手與制廣佛手聚類明顯，兩種模式下的Q2（cum）分別為0.966和0.985，表明模型的可預測準確程度分別為96.6%與98.5%，模型良好。

圖5 OPLS－DA得分圖（A）與模擬驗證圖（B）Fig.5 OPLS－DA model scores（A）and OPLS－DA model permutations（B）

通過置換檢驗，驗證當前參數下OPLS－DA分析得到的模型是否過擬合。置換次數為200次的結果見圖5B，其中虛線為模型所得回歸線，左側藍色Q2值均低于右側的Q2原始值，Q2散點所在回歸線與左側垂直軸交于零點以下，說明OPLS－DA原始模型有效，未出現過擬合。表明廣佛手制品與其同源生品的化學成分存在顯著性差異。

根據變量投影重要性VIP＞1與S-plots圖中p（corr）＞0.58的標準篩選差異化合物，通過文獻檢索、數據庫匹配及裂解規(guī)律，共鑒定出5個顯著性差異成分，分別為：諾米林酸、5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素、棕櫚酸、油酸和水合氧化前胡素（見表3）。

表3 顯著性差異成分Table 3 Significant difference ingredients

比較發(fā)現，上述成分在廣佛手的生品與制品中均有檢出，但含量存在差異，將它們各自在制品與生品中的峰面積進行對比，得到成分含量對比倍數（Fold change，FC），見表3。由表3可見，廣佛手炮制后，差異性成分的含量普遍增加，5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素增加最明顯（FC=29.11），其炮制后的含量約提高29倍。研究發(fā)現，5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素具有在體內外抑制腫瘤的活性［16］，水合氧化前胡素（FC=1.34）可抑制細胞凋亡，具有抗炎功效［17］。因此，推測炮制后廣佛手的抗炎和抑瘤活性強度可能隨著成分含量的變化而改變。

3 結 論

本研究基于UPLC－Q－TOF MS技術在正、負離子模式下采集數據，根據分子離子峰精確質量數、二級譜圖等信息，結合文獻和化合物數據庫，并經標準品驗證共鑒定了生、制廣佛手中37個化學成分，首次建立生廣佛手與制廣佛手的UPLC－Q－TOF MS指紋圖譜。其中生廣佛手指紋圖譜有24個共有峰，鑒定出其中19個成分；制廣佛手有22個共有峰，鑒定出其中14個成分。兩種指紋圖譜有11個共檢出成分，說明兩種指紋圖譜存在一定相似性；同時指出可用于輔助區(qū)分兩者的非共檢出的7個成分：金圣草素-6，8-葡萄糖苷、6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸、3-羥基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸、橙皮素、甲氧基-十五烷酸、3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯、葡萄內酯。所建立的指紋圖譜相似度均大于0.96，結果可靠，可用于廣佛手的真?zhèn)舞b別和質量控制。結合化學模式識別方法，鑒定出生、制廣佛手5個含量顯著性差異成分，其中5-異戊烯氧基-7-甲氧基香豆素的FC值增加最為明顯，可作為區(qū)分生、制廣佛手的化學標志物。研究結果對生、制廣佛手的質量控制及藥效學研究具有一定參考意義。