裸鼠膽囊癌移植瘤血流灌注特征的超聲造影研究

張炎晶,郝艷紅,劉利平,苗 燕,劉靜靜,陳 娟,趙育芳(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲影像科,太原 0000;山西省腫瘤醫(yī)院超聲影像科;山西省人民醫(yī)院超聲科;通訊作者,E-mail:4656007@qq.com)

膽道系統(tǒng)惡性腫瘤危害大,其中以原發(fā)性膽囊癌最常見(jiàn)[1]。膽囊癌具有明確的發(fā)病危險(xiǎn)因素[2],近年來(lái)其全球發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[3]。原發(fā)性膽囊癌起病隱匿,多數(shù)患者中晚期時(shí)才被臨床診斷,因此預(yù)后較差[4],故膽囊癌的早期診斷對(duì)臨床治療方案及預(yù)后起著重要作用,加強(qiáng)膽囊癌基礎(chǔ)研究對(duì)膽囊癌的早期診斷及治療非常必要。本文通過(guò)建立裸鼠低分化膽囊癌皮下移植瘤模型,運(yùn)用實(shí)時(shí)超聲造影檢查結(jié)合TIC定量分析軟件,探討膽囊癌皮下移植瘤超聲造影血流灌注特征。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備

隨機(jī)選擇2只裸鼠接種膽囊癌細(xì)胞株,在裸鼠肩胛區(qū)皮下接種0.2 ml濃度為1×107個(gè)/ml的GBC-SD細(xì)胞懸液,接種成功標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)節(jié)存活且直徑達(dá)5 mm,待成瘤后,麻醉裸鼠(經(jīng)腹腔注射10%濃度水合氯醛),麻妥后剝離瘤體,選取瘤體邊緣相對(duì)活力高的腫瘤細(xì)胞組織,使用眼科剪將這些細(xì)胞組織剪碎制備成體積約1 mm3的組織碎塊,生理鹽水清洗備用。

其余10只待實(shí)驗(yàn)裸鼠同法麻醉后脫毛以碘伏消毒肩胛區(qū)皮膚,以眼科剪在肩胛區(qū)剪開(kāi)長(zhǎng)約2～4 mm的小切口,切口周圍皮下埋入2～3塊備好的瘤體碎塊,每只裸鼠左右側(cè)各1個(gè),共20個(gè)。術(shù)后于后腿部連續(xù)3 d青霉素肌肉注射,預(yù)防術(shù)后感染的發(fā)生,3 d后拆線。21 d建模成功。

1.2 儀器與方法

超聲檢查儀器為GE LOGIQ E9型高檔彩色多普勒超聲診斷儀,選用寬頻線陣探頭,探頭頻率6～15 MHz,機(jī)械指數(shù)MI固定于0.09,造影劑選用SonoVue白色凍干粉末,采用TIC定量分析軟件。造影過(guò)程中各種造影條件設(shè)置固定。

10只裸鼠麻妥后合適體位固定于治療臺(tái)。先以常規(guī)超聲掃查皮下移植瘤,選取腫瘤最大切面,分別測(cè)量其最大左右徑(L)和前后徑(W),計(jì)算瘤體體積(公式V=LW2/2)。啟動(dòng)造影模式,經(jīng)裸鼠尾靜脈團(tuán)注超聲造影劑0.1 ml/次,注射即刻開(kāi)始計(jì)時(shí),動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)觀察并存儲(chǔ)圖像,存儲(chǔ)時(shí)間3 min。

1.3 圖像分析

使用TIC分析軟件,勾畫ROI感興趣區(qū),其內(nèi)瘤體的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)過(guò)程經(jīng)軟件自動(dòng)繪制,生成TIC曲線,得到定量分析參數(shù):到達(dá)時(shí)間(arrival time,AT)、達(dá)峰時(shí)間(time to peak,TTP)、峰值強(qiáng)度(peak intensity,PI)、曲線下面積(area under curve,AUC)等,以上操作均由兩名高年資主治醫(yī)師完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)超聲

種植裸鼠膽囊癌皮下移植瘤共20例,最終造影成功模型16例,常規(guī)超聲測(cè)量瘤體平均左右徑(0.92 ±0.27)cm,前后徑(0.67±0.18)cm,體積(0.25 ±0.22)cm3。瘤體邊界尚清,呈圓形或橢圓形實(shí)性低回聲結(jié)節(jié),瘤體呈外生性及膨脹性生長(zhǎng),內(nèi)部回聲表現(xiàn)不一,可以均勻或不均勻,流體邊緣與皮膚層分界清,超聲檢查中容易識(shí)別,注射造影劑后即刻CDFI可見(jiàn)瘤體內(nèi)血流信號(hào)明顯增多,小血管結(jié)構(gòu)顯示更清晰(見(jiàn)圖1)。

圖1 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤超聲造影前后彩色多普勒血流圖Figure 1 Color doppler flow images of subcutaneously transplanted tumors in nude mice of gallbladder carcinoma before and after contrast-enhanced ultrasound

2.2 病理表現(xiàn)

大體標(biāo)本蒼白、質(zhì)地韌,部分瘤體中央可見(jiàn)壞死物呈乳糜樣。HE染色顯示腫瘤細(xì)胞特征與人膽囊癌相符,可見(jiàn)大量低分化深染巨核細(xì)胞,細(xì)胞排列致密、雜亂,胞質(zhì)豐富、大小不一,腫瘤細(xì)胞核異型性明顯(見(jiàn)圖2)。

2.3 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤超聲造影增強(qiáng)模式

裸鼠膽囊癌皮下移植瘤超聲造影動(dòng)脈早期顯示為快速周邊環(huán)狀增強(qiáng),動(dòng)脈中晚期快速廓清,呈“快進(jìn)快退”。依據(jù)達(dá)峰時(shí)瘤體中心部分是否能完全強(qiáng)化分為整體增強(qiáng)組及環(huán)狀增強(qiáng)組。16例中5例表現(xiàn)為整體均勻增強(qiáng),11例表現(xiàn)為瘤體周邊環(huán)狀增強(qiáng),周邊環(huán)狀增強(qiáng)組瘤體中央均可見(jiàn)無(wú)增強(qiáng)區(qū)。5例整體增強(qiáng)組達(dá)峰后造影劑開(kāi)始廓清呈整體低增強(qiáng);11例環(huán)狀增強(qiáng)組瘤體中心始終未見(jiàn)造影劑進(jìn)入,達(dá)峰后周邊環(huán)狀增強(qiáng)部分開(kāi)始廓清(見(jiàn)圖3)。瘤體大小、體積在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見(jiàn)表1)。

圖2 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤病理Figure 2 Pathological changes of subcutaneously transplanted tumors in nude mice of gallbladder carcinoma

圖3 整體均勻增強(qiáng)組及周邊環(huán)狀增強(qiáng)組超聲造影Figure 3 Contrast-enhanced ultrasound of transplanted tumors in overall uniformly enhanced group and peripherally circularly enhanced group

表1 整體均勻增強(qiáng)組與周邊環(huán)狀增強(qiáng)組移植瘤大小、體積的比較

2.4 裸鼠膽囊癌皮下移植瘤模型兩種增強(qiáng)模式組超聲造影各定量參數(shù)比較

應(yīng)用TIC分析軟件比較兩組移植瘤CEUS各定量參數(shù),結(jié)果顯示整體增強(qiáng)組移植瘤PI及AUC明顯高于環(huán)狀增強(qiáng)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而AT和TTP兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表2,圖4)。

表2 整體均勻增強(qiáng)組與周邊環(huán)狀增強(qiáng)組定量參數(shù)比較

圖4 整體均勻增強(qiáng)組及周邊環(huán)狀增強(qiáng)組超聲造影時(shí)間強(qiáng)度曲線Figure 4 Time intensity curve of contrast-enhanced ultrasound in overall uniformly enhanced group and peripherally circularly enhanced group

3 討論

原發(fā)性膽囊癌起病隱匿,早期診斷困難,多數(shù)患者中晚期才被臨床診斷,惡性程度高,預(yù)后較差[4],超聲檢查是膽囊疾病首選的影像學(xué)方法,盡管常規(guī)超聲能夠正確診斷大多數(shù)膽囊疾病,但是由于常規(guī)超聲難以顯示膽囊病變的微小血管[5],對(duì)于部分膽囊息肉樣病變良惡性的鑒別、厚壁型膽囊癌與慢性膽囊炎以及膽囊腺肌癥的鑒別診斷仍存在困難,常規(guī)超聲對(duì)早期膽囊癌的檢出率僅23%[6]。

隨著實(shí)時(shí)超聲造影檢查技術(shù)的飛速發(fā)展,其對(duì)腫瘤血流灌注能提供更多信息,超聲造影實(shí)時(shí)檢查能準(zhǔn)確顯現(xiàn)瘤體內(nèi)血流灌注的時(shí)間順序和微血管空間分布及差異,而良惡性腫瘤的血流灌注時(shí)間順序和空間分布不同,因此超聲造影技術(shù)可為病灶診斷與鑒別診斷提供基礎(chǔ);利用TIC曲線可獲取超聲造影的相關(guān)參數(shù),通過(guò)瘤體內(nèi)造影劑達(dá)峰時(shí)峰值強(qiáng)度、到達(dá)時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間和曲線下面積等參數(shù),可定量評(píng)價(jià)病灶血流灌注情況;超聲造影結(jié)合TIC定量分析軟件,能夠獲得腫瘤微循環(huán)的多種定量信息,其形態(tài)和參數(shù)變化在腫瘤定性診斷中發(fā)揮著重要作用[7],有效提高超聲對(duì)膽囊病變良惡性診斷的準(zhǔn)確率,對(duì)于鑒別膽囊炎、膽囊息肉、膽囊腺瘤、膽囊癌以及不活動(dòng)的膽泥具有一定的診斷價(jià)值[8]。

本研究中裸鼠膽囊癌皮下移植瘤超聲造影動(dòng)脈早期可見(jiàn)快速環(huán)狀增強(qiáng),動(dòng)脈中晚期快速廓清,呈典型的惡性腫瘤灌注模式“快進(jìn)快退”,符合膽囊癌富血供的病理學(xué)特征。膽囊癌病理表現(xiàn)為有較豐富滋養(yǎng)血管,同時(shí)瘤體內(nèi)可見(jiàn)大量動(dòng)-靜脈瘺,因此CEUS表現(xiàn)為“快進(jìn)快退”的增強(qiáng)模式[9],與楊偉等[10]研究一致。

本組實(shí)驗(yàn)依據(jù)造影劑達(dá)峰時(shí)瘤體中心部分是否能完全增強(qiáng)將其分為整體強(qiáng)化組和環(huán)狀強(qiáng)化組。對(duì)照病理結(jié)果,CEUS表現(xiàn)為整體均勻增強(qiáng)的瘤體其大體標(biāo)本顯示腫瘤呈質(zhì)韌的蒼白色,瘤體中央壞死組織很少或基本沒(méi)有,HE鏡下可見(jiàn)移植瘤細(xì)胞相對(duì)分布均勻,內(nèi)部壞死區(qū)小或不明顯;CEUS表現(xiàn)為周邊環(huán)狀增強(qiáng)的移植瘤切面可見(jiàn)中心為較多淡黃色乳糜樣壞死,瘤體周邊部為質(zhì)韌蒼白色組織,HE染色鏡下見(jiàn)中心部正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失、可見(jiàn)核碎裂、細(xì)胞間質(zhì)崩解,整體分布雜亂呈模糊的顆粒狀及無(wú)定形的紅染物。

超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線獲得的定量參數(shù)中AT為所觀察的ROI內(nèi)造影劑開(kāi)始出現(xiàn)的時(shí)間;TTP為ROI內(nèi)超聲造影劑濃度達(dá)最高峰時(shí)所需時(shí)間,這個(gè)參數(shù)取決于ROI內(nèi)的微循環(huán)血流灌注速度;PI與感興趣區(qū)內(nèi)的造影劑微泡濃度呈正比,微泡濃度又與病灶的血容量呈正比,因此反映了組織微血管密度;AUC反映的是ROI內(nèi)觀察期內(nèi)的平均血流灌注量[11]。有報(bào)道人膽囊良惡性腫瘤超聲造影增強(qiáng)特征差異主要集中在注射造影劑后1 min的時(shí)間段內(nèi)[12],在預(yù)實(shí)驗(yàn)中顯示裸鼠膽囊癌移植瘤超聲造影增強(qiáng)也在注射造影劑后1 min內(nèi),注射造影劑1 min之后時(shí)間內(nèi)的AUC對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究意義不大。本研究中CEUS表現(xiàn)為整體均勻增強(qiáng)的瘤體PI值(反應(yīng)ROI內(nèi)微泡灌注最大濃度)、AUC(反應(yīng)觀察時(shí)間段內(nèi)平均血流灌注量)平均值均明顯高于周邊環(huán)狀增強(qiáng)的瘤體,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明在兩種不同增強(qiáng)模式中整體均勻增強(qiáng)組瘤體內(nèi)的血流灌注量更大,微泡灌注濃度更高?？紤]其原因可能是周邊環(huán)狀增強(qiáng)瘤體內(nèi)部出現(xiàn)壞死,其生長(zhǎng)速度較整體均勻增強(qiáng)瘤體快,瘤體內(nèi)部張力高(本研究中兩組瘤體大小并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異),周邊腫瘤細(xì)胞受擠壓分布較緊密,阻礙滋養(yǎng)血管形成,滋養(yǎng)血管形成較少,因此峰值強(qiáng)度低,AUC低[13]。

綜上所述,裸鼠膽囊癌皮下移植瘤超聲造影檢查時(shí)可分為兩種“快進(jìn)快出”的強(qiáng)化模式,與大體病理相對(duì)應(yīng),超聲造影定量分析可評(píng)價(jià)裸鼠膽囊癌血流灌注信息,并可更精確反映兩種增強(qiáng)類型的差異。