HPLC測(cè)定藿香正氣制劑中2種抗病毒類成分的含量

胡冬青,王 偉(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科,濟(jì)南 250011;通訊作者,E-mail:sminling365@163.com)

藿香正氣制劑出自宋代《太平惠民和劑局方》,由藿香、厚樸、白芷、陳皮、蒼術(shù)等10味中藥組成,具有解表化濕、理氣和中等功效,常用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒,臨床上用于頭痛昏重、胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉等癥狀的治療[1,2]。隨著現(xiàn)代中藥制劑的發(fā)展,為滿足易服、便攜的用藥需求,已開發(fā)制成多種制劑,如藿香正氣口服液、藿香正氣散、藿香正氣片、藿香正氣水、藿香正氣丸等[3]。

2019年12月以來,新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性肺炎(COVID-19)在全世界蔓延,奪走了數(shù)百萬(wàn)人的生命,被列為“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[4],給全世界帶來了嚴(yán)重的危害,迫切需要尋找一種快速、有效的治療方法。我國(guó)救治新冠肺炎的成功經(jīng)驗(yàn)表明,中醫(yī)藥能夠在預(yù)防、治療、康復(fù)等方面發(fā)揮有效作用[5]。據(jù)報(bào)道,藿香正氣膠囊(丸、水、口服液)等制劑對(duì)COVID-19具有解表化濕、理氣和中作用,可有效緩解乏力、胃腸不適等癥狀,是《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第五版)》中推薦的醫(yī)學(xué)觀察期乏力伴胃腸不適者的預(yù)防用藥[6]。研究表明,藿香正氣制劑中含有黃酮、香豆素、揮發(fā)油、生物堿等多類成分,其中芹菜素、槲皮素等黃酮類成分具有顯著的抗病毒作用[7-10]。同時(shí),鄧燕君等[11]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接法對(duì)藿香正氣口服液預(yù)防新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的活性化合物進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,抗病毒綜合評(píng)分最高的5個(gè)化合物分別是槲皮素、異鼠李素、葛花苷元、山柰酚、漢黃芩素。紀(jì)敬敏等[12]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討了藿香正氣液干預(yù)新型冠狀病毒感染的潛在靶點(diǎn),結(jié)果顯示,決明色酮、芹菜素、鼠李素、槲皮素等化合物具有較強(qiáng)的抗病毒靶標(biāo)。目前,藿香正氣制劑的質(zhì)量控制主要以厚樸酚、和厚樸酚及橙皮苷為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定,未建立黃酮類成分HPLC含量測(cè)定方法,建議在藿香正氣制劑研究生產(chǎn)和質(zhì)量控制過程中,對(duì)槲皮素、芹菜素、異鼠李素等化學(xué)成分進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注和控制。因此,本課題組以槲皮素和芹菜素2種黃酮類成分為指標(biāo)成分,建立了同時(shí)測(cè)定藿香正氣系列制劑中槲皮素和芹菜素2種黃酮類成分含量的HPLC方法,為藿香正氣制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀:包括PDA檢測(cè)器,Empower工作站(美國(guó)Waters公司);CPA225D型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán));KQ-500DE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:槲皮素(批號(hào)100081-200406)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,芹菜素(批號(hào)AF9032008)購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;藿香正氣膠囊(同藥集團(tuán),批號(hào)分別為20030035,20030012),藿香正氣軟膠囊(神威藥業(yè),批號(hào)分別為200706,200918),藿香正氣合劑(太子藥業(yè)有限公司,批號(hào)分別為200612,200714)、藿香正氣水(云南白藥集團(tuán),批號(hào)分別為S0055,S0042)、藿香正氣滴丸(天士力控股集團(tuán),批號(hào)分別為200316,200518)、藿香正氣丸(上海寶龍安慶藥業(yè),批號(hào)分別為20200504,20200615)購(gòu)自濟(jì)南市愛心大藥房甲醇為HPLC級(jí)(德國(guó)Merck公司);醋酸為分析純(美國(guó)TEDIA公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Luna?-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱;以甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫:0～15 min,40%～45%A;15～20 min,45%～52%A;20～40 min,52%～55%A;流速1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm;進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素對(duì)照品12.86 mg、芹菜素對(duì)照品10.22 mg,精密稱定,置于100 ml的量瓶中,加甲醇溶解至刻度,制成質(zhì)量濃度為128.6 μg/ml和102.2 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 藿香正氣膠囊:取10粒本品,去外殼,研細(xì)混合,精密稱取1.0 g置于10 ml容量瓶中,加70%甲醇至刻度,超聲30 min,放冷過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液;藿香正氣丸:取10粒本品,研細(xì)后混勻,將內(nèi)容物混勻后精密稱取1.0 g置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超聲30 min,放冷過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液;藿香正氣滴丸:取1袋本品,研細(xì)后混勻,精密稱取1.0 g置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超聲30 min,放冷過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液;藿香正氣水:精密移取本品1.0 ml,置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超聲提取30 min,放冷過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液;藿香正氣軟膠囊:取10粒本品,去除膠囊殼,混勻內(nèi)容物,精密稱取1.0 g置于10 ml量瓶中,加70%甲醇超聲30 min,放冷,過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液;藿香正氣合劑:精密移取本品1.0 ml,置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超聲提取30 min,放冷過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取上述對(duì)照品溶液、不同劑型供試品溶液、陰性溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜,見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10 ml至10 ml容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度。分別精密吸取10 μl注入HPLC分析,以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣濃度X進(jìn)行回歸方程計(jì)算,得槲皮素、芹菜素在0.643～128.6 μg/ml,0.511～102.2 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積的回歸方程分別為Y=47 491X-3 145.5(r=0.999 9)和Y=40 312X+8 950.2(r=0.999 7)。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得槲皮素、芹菜素的峰面積RSD分別為0.94%和1.02%(見表1)。表明儀器精密度良好。

1.槲皮素;2.芹菜素圖1 混合對(duì)照品與藿香正氣不同制劑的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC of mixed reference substance and Huoxiang Zhengqi preparations

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次(批號(hào)20030035)的藿香正氣膠囊,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,平行6份,進(jìn)樣分析,測(cè)得槲皮素、芹菜素的峰面積RSD分別為1.02%和1.33%(見表1)。表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次(批號(hào)20030035)的藿香正氣膠囊供試品溶液,分別在0,2,4,6,8,12,24 h進(jìn)樣分析,測(cè)得不同藿香正氣制劑槲皮素、芹菜素的峰面積RSD(見表2),結(jié)果表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 精密度和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的(批號(hào)20030035)藿香正氣膠囊樣品6份,每份約1.0 g,按約1 ∶1的比例加入槲皮素、芹菜素對(duì)照品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣分析,計(jì)算回收率,結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同藿香正氣制劑,平行3份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,以外標(biāo)法計(jì)算含量,結(jié)果見表4。

表4 不同制劑含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

黃酮類成分帶有酚羥基,顯一定的弱酸性。在流動(dòng)相系統(tǒng)的考察中,參照文獻(xiàn)并選擇了甲醇-0.4%磷酸溶液、甲醇-0.4%醋酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%醋酸溶液4種流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果顯示,以甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí),2種被測(cè)成分的分離度、峰形最佳,基線平穩(wěn)。

3.2 制備方法的選擇

分別對(duì)提取溶劑(甲醇、乙醇),提取溶劑濃度(50%,70%,100%)和超聲提取時(shí)間(15,30,45,60 min)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示,以70%甲醇、超聲提取30 min為提取最佳條件。

3.3 指標(biāo)成分的選擇

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)藿香正氣口服液預(yù)防新型冠狀病毒肺炎的活性化合物研究結(jié)果顯示,藿香正氣制劑中黃酮類成分芹菜素、槲皮素具有顯著的抗病毒作用,抗病毒綜合評(píng)分最高,與洛匹那韋和瑞德西韋有相近的結(jié)合能,因此,選擇芹菜素和槲皮素作為測(cè)定指標(biāo)成分。

綜上所述,為進(jìn)一步完善藿香正氣制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),提升藿香正氣制劑質(zhì)量控制水平,本試驗(yàn)建立了藿香正氣制劑中槲皮素和芹菜素2種成分的HPLC含量同時(shí)測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與2020版《中國(guó)藥典》中主要以厚樸酚、和厚樸酚及橙皮苷等成分為指標(biāo)成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法相比較,本研究所建立的方法增加了質(zhì)量控制成分類別,提高了產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平,且方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定簡(jiǎn)便、回收率高,可以用于藿香正氣制劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制。