黃脊竹蝗熒光定量PCR內(nèi)參基因的鑒定與篩選*

方林鑫 李志紅 張守科 張 威 舒金平 王浩杰

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 杭州 311400)

黃脊竹蝗(Ceracriskiangsu)是重要的森林害蟲(chóng)，危害100多種竹子，分布廣、暴發(fā)頻繁，常造成重大經(jīng)濟(jì)損失，制約我國(guó)竹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展(徐天森等，2004)。2020年，黃脊竹蝗飛躍中老邊境侵入我國(guó)，引發(fā)蝗災(zāi)，損失慘重。利用黃脊竹蝗的“趨泥行為”誘殺成蟲(chóng)是當(dāng)前防治該蟲(chóng)的主要手段，而明確黃脊竹蝗“趨泥行為”的發(fā)生機(jī)制是制定高效行為調(diào)控策略的關(guān)鍵(滕瑩，2012；張守科等，2017；張威等，2018)。目前，僅在行為和生理生化層面上對(duì)竹蝗“趨泥行為”的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行了探索，要進(jìn)一步揭示其分子機(jī)理，基因調(diào)控層面的解析是必要的研究?jī)?nèi)容，其中相關(guān)基因的定量表達(dá)分析至關(guān)重要，但至今尚未有黃脊竹蝗內(nèi)參基因篩選和鑒定方面的報(bào)道。

反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription-PCR，RT-qPCR)具有定量準(zhǔn)確、靈敏、通量大等優(yōu)點(diǎn)，是驗(yàn)證基因特異性表達(dá)及研究基因功能的有效方法(Yanetal.，2012；Ibanezetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。在RT-qPCR試驗(yàn)中，RNA濃度、cDNA轉(zhuǎn)換效率、擴(kuò)增效率等因素存在誤差且無(wú)法避免，最終影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了減輕誤差因素的干擾，在檢測(cè)基因表達(dá)水平變化時(shí)常需要引入內(nèi)參基因作為參照物(Radonietal.，2004；Huggettetal.，2005；Mughaletal.，2018)，借助樣品中內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以提升結(jié)果的可信度，而篩選不同試驗(yàn)條件下合適的內(nèi)參基因是開(kāi)展相關(guān)研究的關(guān)鍵(陳孝仁等，2012；Liangetal.，2014)。理論上，內(nèi)參基因應(yīng)在任何試驗(yàn)條件或任意部位組織細(xì)胞中均可穩(wěn)定表達(dá)，并且其表達(dá)量不受任何因素影響(Kozeraetal.，2013；Jansketal.，2013)，因此內(nèi)參基因一般選用傳統(tǒng)的管家基因，如β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、α-延伸因子基因(EF1-α)、核糖體蛋白基因(RPS、RPL)和18S核糖體RNA基因(18SrRNA)等(S?kalskaetal.，2006；史彩華等，2016)。同時(shí)，理想的內(nèi)參基因不存在假基因，具有高度特異性，與目的基因也具有相似的表達(dá)量(Wanetal.，2010；Caoetal.，2012；Ferdousetal.，2015)。但研究表明，同一種內(nèi)參基因常因物種、發(fā)育條件、環(huán)境脅迫等因素的差異，其表達(dá)穩(wěn)定性存在顯著差異，并不存在絕對(duì)穩(wěn)定的萬(wàn)能內(nèi)參基因(Yuanetal.，2014；Shakeeletal.，2018)，且內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)也是相對(duì)的(Lüetal.，2018)。在開(kāi)展基因定量研究時(shí)，需選擇在同試驗(yàn)條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，且通常會(huì)選用2個(gè)或以上內(nèi)參基因，以保證獲取更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)(史彩華等，2016；Shivhareetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。本研究使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件對(duì)不同齡期、成蟲(chóng)不同性別及不同組織黃脊竹蝗的內(nèi)參基因進(jìn)行篩選和穩(wěn)定性分析，以期為黃脊竹蝗及直翅目其他昆蟲(chóng)基因定量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)及處理

黃脊竹蝗卵采自湖南省益陽(yáng)市桃江縣竹蝗發(fā)生區(qū)(111°85′32″ E，28°42′89″ N)，置于溫室中(26 ±4 ℃，RH70%±5%)孵化，孵化后的蝗蝻轉(zhuǎn)移至2.0 m×2.0 m×2.0 m的60目大網(wǎng)中用2年生盆栽毛竹(Phyllostachysedulis)飼養(yǎng)至成蟲(chóng)。對(duì)孵化前3天的卵粒，孵化后不同齡若蟲(chóng)(1～5齡)及成蟲(chóng)進(jìn)行隨機(jī)取樣，3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)4粒卵或4頭蝗蟲(chóng)(雌、雄各2頭)。解剖成蟲(chóng)頭部、觸角、唇須、精巢、卵巢和飛行肌等器官/組織樣品。所有樣品用液氮速凍，并保存于 -80 ℃冰箱中供試。

1.2 試劑及主要儀器

試劑盒：RNAprep Pure Tissue Kit(天根生化科技有限公司，中國(guó))、FastQuant RT Super Mix(天根生化科技有限公司，中國(guó))、2 × Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，中國(guó))、PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystem，美國(guó))；化合物：β-巰基乙醇(CAS：60-24-2，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán))；主要儀器：LifeECO-PCR儀(杭州博日科技有限公司，中國(guó))、Q225 q-pcr熒光定量PCR儀(北京酷搏科技有限公司，中國(guó))、SIGMA-3K15離心機(jī)(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司，德國(guó))、Q6000-Quawell超微量可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，美國(guó))。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

按照試劑盒說(shuō)明對(duì)不同齡若蟲(chóng)、成蟲(chóng)不同部位進(jìn)行總RNA提取，利用可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)總RNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，樣品OD260/OD280=1.94 ～ 2.02，凝膠電泳結(jié)果均清晰可見(jiàn)28S與18S條帶，隱約可見(jiàn)5S條帶。每個(gè)樣品按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成總cDNA。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程采用20 μL反應(yīng)體系：4 × FQ-RT Super Mix 5 μL，Total RNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。反轉(zhuǎn)錄步驟：42 ℃持續(xù)15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，95 ℃持續(xù)3 min(酶滅活過(guò)程)。總RNA于 -80 ℃低溫保存，用于合成cDNA；總cDNA于 -20 ℃低溫保存，用于RT-qPCR。

1.4 引物的設(shè)計(jì)和合成

基于黃脊竹蝗的二代和三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，選擇了9種昆蟲(chóng)常用的內(nèi)參基因：TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin和18SrRNA。NCBI上檢索獲得9種內(nèi)參基因序列(表1)，利用SeqHunter 2軟件在黃脊竹蝗全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(本試驗(yàn)室構(gòu)建)中比對(duì)同源序列；基于同源性最高的序列，使用NCBI在線(xiàn)工具Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)定量PCR特異性引物(表2)，引物長(zhǎng)度為20～22個(gè)堿基；退火溫度：18SrRNA為59 ℃，其余均為60 ℃；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大于90 bp、小于250 bp。引物均由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 RT-qPCR

采用10 μL反應(yīng)體系：PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物(2 μmol·μL-1)各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。qPCR采用3步標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)模式：UDG酶激活50 ℃ 120 s；預(yù)變性95 ℃ 120 s；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集于延伸階段。qPCR反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行溶解曲線(xiàn)的分析，溶解曲線(xiàn)條件如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s(此過(guò)程進(jìn)行熒光采集)。每樣品進(jìn)行3次平行技術(shù)重復(fù)，Ct值取3次結(jié)果平均值。取1齡～5齡若蟲(chóng)頭部及雄性與雌性成蟲(chóng)的觸角、唇須、頭部、肌肉組織和精巢/卵巢共15個(gè)組織樣品，每樣品3個(gè)重復(fù)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制和引物擴(kuò)增效率驗(yàn)證

將總cDNA模板進(jìn)行倍數(shù)為5的梯度稀釋?zhuān)传@得50、5-1、5-2、5-3、5-4ng·μL-1濃度的cDNA模板，按照1.5節(jié)流程進(jìn)行qPCR。依據(jù)結(jié)果，以lg(cDNA模板濃度)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，利用SPSS 20軟件分析二者線(xiàn)性關(guān)系，估計(jì)線(xiàn)性方程，得到判定系數(shù)(R2)與斜率，根據(jù)公式E=(10(-1/slope)-1)× 100求得擴(kuò)增效率E(Radonietal.，2004)。

1.7 數(shù)據(jù)處理及候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

不同組織分析時(shí)選用雄成蟲(chóng)頭部、觸角、唇須、肌肉組織和精巢，不同性別分析時(shí)分別選用雌、雄成蟲(chóng)頭部、肌肉、精/卵巢，不同發(fā)育期分析選用1齡～5齡若蟲(chóng)。采用SPSS 20軟件對(duì)RT-qPCR所得Ct值整體進(jìn)行方差分析，利用GeNorm(Vandesompeleetal.，2002)、NormFinder(Andersenetal.，2004)和BestKeeper(Pfaffletal.，2004)軟件評(píng)價(jià)9種候選內(nèi)參基因在不同條件下的穩(wěn)定性，進(jìn)行分析與篩選。將Ct進(jìn)行2-Δt轉(zhuǎn)換相對(duì)表達(dá)量，在一個(gè)內(nèi)參基因中，同一條件下所有樣品Ct與最小Ct之差為Δt，再計(jì)算2-Δt，2-Δt用于GeNorm與NormFinder的分析。GeNorm通過(guò)計(jì)算會(huì)得出每個(gè)候選內(nèi)參基因的M，M越小的內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，該軟件的特點(diǎn)是最終挑選2個(gè)或2個(gè)以上最適內(nèi)參基因，內(nèi)參基因個(gè)數(shù)判定值為V。當(dāng)Vn/Vn+1<0.15，n取最小值時(shí)，n即為最適內(nèi)參基因個(gè)數(shù)；Vn/n + 1均大于0.15時(shí)，則以最小Vn/n + 1值時(shí)的內(nèi)參基因個(gè)數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)(馬飛，2012)。NormFinder計(jì)算原理與GeNorm相似，也是通過(guò)計(jì)算獲得每個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越小，代表該內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定，依據(jù)其穩(wěn)定值進(jìn)行排序，該軟件的特點(diǎn)是計(jì)算樣品間的變異，而且只篩選出一個(gè)最合適的內(nèi)參基因。BestKeeper最多只能進(jìn)行10個(gè)內(nèi)參基因和10個(gè)目標(biāo)基因表達(dá)水平的比較，將Ct輸入后，自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)變異系數(shù)(SD)與差異值(P)等數(shù)據(jù)用以判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，SD越小，該內(nèi)參基因越穩(wěn)定，若P大于0.05，則結(jié)果無(wú)意義，該軟件的特點(diǎn)是可以分析目的基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種內(nèi)參基因分析與Ct值比較

參照其他昆蟲(chóng)已公布序列(馮波等，2016；Dzakietal.，2017；Quetal.，2018)，篩選到9種候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(表1)。9種黃脊竹蝗的內(nèi)參基因均首次被鑒定，與其他昆蟲(chóng)相應(yīng)基因序列一致性均高于70%；另外，黃脊竹蝗9種候選內(nèi)參基因匹配期望值(E)為0(或近為0)，表明比對(duì)基因完全匹配，這也說(shuō)明了這些內(nèi)參基因的高度保守性。

表1 黃脊竹蝗內(nèi)參基因比對(duì)Tab.1 Comparison with hit species on reference genes of Ceracris kiangsu

2.2 引物特異性評(píng)價(jià)與擴(kuò)增效率檢驗(yàn)

9種候選內(nèi)參基因不同濃度梯度cDNA模板與Ct值間存在顯著的線(xiàn)性相關(guān)性(P<0.001，0.988 ≤R2≤ 0.998，表2)。每種內(nèi)參基因RT-qPCR溶解曲線(xiàn)圖都呈現(xiàn)明顯單一峰，驗(yàn)證了引物的特異性(圖1)。計(jì)算擴(kuò)增效率，E均在93%～114%之間，表明RT-qPCR反應(yīng)有效。

表2 候選內(nèi)參基因RT-qPCR引物序列、擴(kuò)增效率及判定系數(shù)Tab.2 Sequence,amplification efficiency and determination coefficient of the RT-qPCR primers for candidate reference genes

圖1 不同濃度梯度9種內(nèi)參基因溶解曲線(xiàn)Fig.1 Melting curve of nine reference genes with different concentration gradients

2.3 9種內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)水平

所有樣品RT-qPCR結(jié)果顯示，整體Ct范圍為7.54～36.22之間，各內(nèi)參基因Ct值組間差異顯著(F=181.95，P<0.0001)。其中，EF1A基因Ct(30.08 ± 2.26)最大，顯著大于除AK(28.23 ± 3.45)和GAPDH(28.76 ± 1.99)外的其他候選基因(圖2)。Actin(23.55 ± 3.84)18SrRNA(10.78 ± 2.58)作為傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，表達(dá)豐度相對(duì)較高；除18SrRNA與Actin外，各基因Ct表達(dá)豐度均在25以上(圖2)。Actin的Ct波動(dòng)最大，變異值達(dá)到13.98；GAPDH在各樣品中表達(dá)量波動(dòng)最小，變異值為6.33。除AK(5.10)和Actin(6.12)外，各基因四分位差(IQR)均小于4，樣品Ct數(shù)據(jù)集中(圖2)。

圖2 9種候選內(nèi)參基因在所有樣品中的CtFig.2 Ct value of nine reference genes in all samples不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P <0.05)。Different lowercase letters mean significant difference(P <0.05).

2.4 GeNorm軟件分析

不同組織分析中，V4/5(0.323)的值最小，所以9種待選基因中有4種基因適合作為成蟲(chóng)不同組織qPCR的內(nèi)參基因，依照M排序依次為RPL10、TUB、GAPDH和RPS27A(圖3A)。不同性別分析與不同組織分析V的結(jié)果相似，均大于0.3，且V2/3為最小值，故RPL10與GAPDH為不同性別qPCR最適內(nèi)參基因(圖3B)。在不同齡若蟲(chóng)分析時(shí)，V3/4=0.149 <0.15，因此有3種基因適合作為不同齡若蟲(chóng)qPCR的內(nèi)參基因，依照M排序依次為RPS3、RPL10和GAPDH(圖3C)。

圖3 GeNorm軟件評(píng)價(jià)9種內(nèi)參基因穩(wěn)定性Fig.3 Stability of nine reference genes estimated by GeNorm softwareA：不同組織Different tissues；B：不同性別Different genders ；C：不同齡若蟲(chóng)Different instars；1:TUB;2:RPS27A;3:RPL10;4:AK;5:GAPDH;6:EF1A;7:RPS27A;8:Actin;9:18S rRNA。括號(hào)內(nèi)外數(shù)字表示基因穩(wěn)定值一致。The two gene in and outside the round bracket mean the same stability.

2.5 NormFinder軟件分析

不同組織分析時(shí)，最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)镚APDH(0.320)，RPL10(0.739)次之；不同性別分析時(shí)，最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)镚APDH(0.318)，RPL10(0.458)次之；不同齡若蟲(chóng)分析時(shí)，最穩(wěn)定的2種內(nèi)參基因依次為RPS3(0.107)和RPL10(0.237)(表3)。

表3 NormFinder軟件評(píng)價(jià)9個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性Tab.3 Stability of nine reference genes estimated by NormFinder software

2.6 BestKeeper軟件分析

不同組織分析時(shí)，穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因?yàn)镽PL10，18SrRNA次之(雖然EF1A與TUB2種基因的SD比18SrRNA小，但其P均大于0.05，穩(wěn)定值無(wú)意義，不適合作為內(nèi)參基因)。不同性別分析時(shí)，SD最小的2種內(nèi)參基因?yàn)镽PL10與GAPDH，EF1A的P大于0.05，穩(wěn)定值無(wú)意義，不適合作為內(nèi)參基因。不同齡若蟲(chóng)分析時(shí)，僅4種基因的P小于0.05，按SD由小到大依次為RPL10、RPS3、AK、Actin，可作為內(nèi)參基因(表4)。

表4 BestKeeper軟件評(píng)價(jià)9種內(nèi)參基因穩(wěn)定性Tab.4 Stability of nine reference genes estimated by BestKeeper software

3 討論

本研究選擇昆蟲(chóng)常用的內(nèi)參基因在黃脊竹蝗不同發(fā)育階段、不同性別及不同組織中的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，篩選出了穩(wěn)定值合適的基因作為不同條件下的內(nèi)參基因。首次對(duì)黃脊竹蝗9種候選內(nèi)參基因(TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin、18SrRNA)進(jìn)行評(píng)價(jià)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這9種內(nèi)參基因與其他昆蟲(chóng)相應(yīng)基因序列一致性極高，匹配差異小，是較佳的內(nèi)參基因候選者，同時(shí)也進(jìn)一步證明了這些內(nèi)參基因在昆蟲(chóng)進(jìn)化中具備高度保守性。

內(nèi)參基因的篩選通常采用專(zhuān)業(yè)軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值進(jìn)行分析，并基于各軟件判定的穩(wěn)定值進(jìn)行綜合排序以選定合適的內(nèi)參基因。大量研究結(jié)果表明，多內(nèi)參基因組合較單一基因更具優(yōu)勢(shì)，但過(guò)多的內(nèi)參基因會(huì)造成試驗(yàn)數(shù)據(jù)冗雜，使后續(xù)的基因表達(dá)量計(jì)算更為繁瑣，因此內(nèi)參基因的最佳數(shù)目通常為2個(gè)(王金星等，2014；Shuetal.，2018；Wangetal.，2018)。本研究使用3個(gè)軟件對(duì)不同條件下的黃脊竹蝗內(nèi)參基因穩(wěn)定值進(jìn)行了獨(dú)立分析，盡管各軟件的計(jì)算原理不同，但在不同條件分析時(shí)，給出穩(wěn)定性排名前2位的內(nèi)參基因高度重合(圖3、表3、表4)，因此2個(gè)內(nèi)參基因是本研究最理想的數(shù)目，與多數(shù)學(xué)者的建議一致。

內(nèi)參基因的選擇因物種或發(fā)育等條件的差異而不同。不同物種之間，最合適內(nèi)參基因的選擇往往不同，GAPDH與UCCR可以作為斜紋夜蛾(Spodopteralitura)不同蟲(chóng)態(tài)的內(nèi)參基因(Luetal.，2013)，而金紋細(xì)蛾(Lithocolletisringoniella)不同蟲(chóng)態(tài)的最適內(nèi)參基因?yàn)棣?TUB和β-actin(郭長(zhǎng)寧，2014)；東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)在不同齡進(jìn)行內(nèi)參基因篩選時(shí)，最合適內(nèi)參基因?yàn)棣?actin和RP49(崔淼等，2014)。而本研究結(jié)果表明，在黃脊竹蝗不同齡若蟲(chóng)階段最適內(nèi)參基因組合為RPS3與RPL10(圖3、表3、表4)。除物種因素外，內(nèi)參基因的選擇與蟲(chóng)態(tài)和昆蟲(chóng)身體組織密切相關(guān)。Zhang等(2015)研究表明棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)幼蟲(chóng)的不同組織中RPS15和RPL13是最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而成蟲(chóng)的最合適內(nèi)參基因?yàn)镋F與RPL27。本研究結(jié)果表明黃脊竹蝗成蟲(chóng)不同組織間最穩(wěn)定內(nèi)參基因與若蟲(chóng)期最適內(nèi)參基因一致，均為RPS3與RPL10。另外，性別也是影響內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)估的重要因素之一。馮波等(2016)發(fā)現(xiàn)，在松褐天牛不同性別內(nèi)參基因篩選時(shí)，GAPDH與TUB是最合適的組合；對(duì)于牧草盲蝽(Lyguspratensis)，SDHA+GST的組合是不同性別成蟲(chóng)穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因(賈冰等，2019)；而本研究結(jié)果顯示RPL10+GAPDH組合是黃脊竹蝗不同性別成蟲(chóng)最適合的內(nèi)參基因(圖3B,表3、4)。

研究表明，RPL10基因在斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、二化螟(Chilosuppressalis)等植食性昆蟲(chóng)不同組織、不同種群密度飼養(yǎng)及不同取食條件下表達(dá)非常穩(wěn)定，適合做內(nèi)參基因(Luetal.，2013；徐紅星等，2019)，而本研究中，GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件分析表明，RPL10基因在黃脊竹蝗不同齡期若蟲(chóng)、雌、雄成蟲(chóng)及不同組織中均穩(wěn)定表達(dá)(圖3B，表3、4)。不同若蟲(chóng)齡分析時(shí)，基于GeNorm與NormFinder評(píng)價(jià)，RPS3是穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因(圖2、表3，表4)。RPS3的穩(wěn)定性在粉莖螟(Sesamianonagrioides)、家蠶(Bombyxmori)、步甲(Carabidae)中也得到印證，可以作為特定條件下基因表達(dá)的內(nèi)參基因(杜暢，2013；Luetal.，2015；劉小強(qiáng)等，2018)。GAPDH是參與糖酵解反應(yīng)的酶，廣泛分布于各種組織中，在進(jìn)化上高度保守。作為傳統(tǒng)的持家基因，GAPDH常常被作為內(nèi)參基因用于各種昆蟲(chóng)基因表達(dá)研究中。GAPDH在松褐天牛不同發(fā)育階段、不同性別的化學(xué)感受組織中表達(dá)非常穩(wěn)定(馮波等，2016)；美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)內(nèi)參基因的篩選中，在不同溫度處理下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合是EF1A和GAPDH(陶蓉等，2019)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了GAPDH基因的穩(wěn)定性，GAPDH符合BestKeeper軟件對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的要求(表4)；同時(shí)在NormFinder軟件分析不同組織與不同性別時(shí)，穩(wěn)定性最高(表3)。GeNorm分析認(rèn)為，GAPDH與RPL10是不同性別下基因表達(dá)研究中最合適的內(nèi)參基因組合(圖3)。

4 結(jié)論

本研究首次在黃脊竹蝗轉(zhuǎn)錄組基因中鑒定9種內(nèi)參基因，并成功設(shè)計(jì)這些基因RT-qPCR特異性引物。利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3個(gè)軟件對(duì)這9種候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合參考3個(gè)軟件的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)，在不同組織分析時(shí)，最合適內(nèi)參基因?yàn)镽PL10和RPS3；在不同性別分析時(shí)，RPL10與GAPDH為穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因組合；在不同若蟲(chóng)齡分析時(shí)，RPS3和RPL10是最合適的內(nèi)參基因。本研究為后續(xù)黃脊竹蝗功能基因驗(yàn)證及相對(duì)表達(dá)量研究奠定了基礎(chǔ)。