茉莉酸甲酯對紅地球葡萄采后貯藏品質(zhì)和病害的影響

鄭素慧，何 慶，張 健，關(guān)軍鋒，秦南南，楊怡靖銘，劉雪艷，吳 斌

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051)

0 引 言

【研究意義】紅地球葡萄(VitisviniferaL. cv. Red Globe)以其果皮厚實、果肉飽滿、口感獨特和耐貯藏的特點[1]，但葡萄果實在采后貯藏過程中易產(chǎn)生色澤變化、風(fēng)味變劣、營養(yǎng)物質(zhì)流失等[2]。由于葡萄皮薄多汁、果實組織嬌嫩，在采摘、運輸和貯藏過程中易遭受機械損傷。研究茉莉酸甲酯(MeJA)浸泡處理對葡萄采后病害的控制及貯藏品質(zhì)的影響。對于保持紅地球葡萄貯期果實品質(zhì)和控制灰霉病害發(fā)生有實際意義。【前人研究進展】目前，采用二氧化硫(Sulfur dioxide,SO2)熏蒸結(jié)合冷藏仍然是控制葡萄真菌腐爛以及保持貯藏品質(zhì)的主要方法[3]，紅地球葡萄的植物學(xué)性狀決定其對SO2非常敏感，劑量稍不適合就會發(fā)生SO2傷害[4]。李月明等[5]使用可降解殼聚糖淀粉抗菌復(fù)合膜保鮮紅提葡萄，貯藏60 d后，好果率仍達到60%以上。呂明珠等[6]使用體積分?jǐn)?shù)為1.0%的肉桂精油在2℃，相對濕度90%條件下保鮮紅提葡萄，可有效抑制呼吸強度，保鮮期可達63 d。采用1-MCP、冰溫、臭氧、醋酸、涂膜技術(shù)等方法保鮮葡萄[7-8]，盡管很多研究報道了葡萄的貯藏保鮮方法，但大多數(shù)為物理化學(xué)貯藏，且效果并不理想，尋找替代SO2熏蒸控制葡萄采后病害，安全無殘留并能維持果實品質(zhì)的貯藏條件、采后處理技術(shù)與材料等尤為重要?！颈狙芯壳腥朦c】茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)是高等植物體內(nèi)天然存在的生長調(diào)節(jié)因子，可在植物細胞內(nèi)發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用來調(diào)控植物生長發(fā)育、后熟衰老、抗逆性和次生代謝產(chǎn)物合成等一系列生理生化反應(yīng)[9]。外源MeJA處理能夠誘導(dǎo)果實提高防御酶的活性，提高藍莓[10]、甜瓜[11]、獼猴桃[12]、蘋果[13]等果實的抗病性，減少采后腐爛的發(fā)生。近年來，關(guān)于MeJA應(yīng)用于采后果蔬貯藏保鮮的研究報告不斷增多，但MeJA能否維持新疆紅地球葡萄產(chǎn)地短期鮮銷品質(zhì)及控制灰霉病還未進行深入研究。研究茉莉酸甲酯(MeJA)浸泡處理對葡萄采后病害的控制及貯藏品質(zhì)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以新疆紅地球葡萄為材料，對葡萄果實進行不同濃度的MeJA浸泡處理，比較分析MeJA處理后果實的貯藏效果，以及在損傷接種條件下對病原菌的誘導(dǎo)抗病效應(yīng)，為MeJA應(yīng)用于葡萄貯運保鮮提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

紅地球葡萄(VitisviniferaL. cv. Red Globe)，2016年9月和2017年9月均采摘于昌吉三工鎮(zhèn)葡萄種植園(2016年開展?jié)舛群Y選試驗，2017年開展相關(guān)機理試驗)。挑選大小均一、色澤相近、果形端正、無機械損傷和病蟲害的果實，采后當(dāng)日運回實驗室冷庫(0±1)℃進行預(yù)冷，預(yù)冷12 h后待用。

灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所分離、鑒定并保存。

1.2 方 法

1.2.1 MeJA浸泡處理

通過預(yù)實驗選擇設(shè)定3個MeJA處理濃度，葡萄果實表面經(jīng)自來水沖洗干凈后分別在50、100和200 μmol/L(含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80)的MeJA中浸泡10 min，以清水為對照(CK)，自然晾干。置于0℃±1℃下貯藏60 d，每隔10 d測定果實各相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 灰葡萄孢子懸浮液的制作

參考鄧惠文[14]的方法配制孢子懸浮液。將已長出菌絲的菌株轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，用體積分?jǐn)?shù)為0.05%的Tween-80無菌水沖洗平板、收集孢子懸液，并用血球計數(shù)板計數(shù)，最終將孢子懸浮液濃度稀釋至1×106個/mL。

1.2.3 不同濃度MeJA對果實灰霉病的防效損傷接種處理

參照Yao等[15]的方法。處理后的葡萄放置24 h后，先用75%的酒精擦拭果實表面，然后在果實赤道部位用滅菌竹簽刺1個孔(直徑2 mm，深度2 mm)，待傷口表面晾干后，用微量進樣器向孔內(nèi)注入10 μL預(yù)先配置好的菌懸液。待菌液完全風(fēng)干后將果粒裝入塑料盒中(175 mm×135 mm×76 mm，盒蓋上有6個孔，直徑1 cm)，接種面向上，置于室溫(25±1)℃，相對濕度為 60%～65%的環(huán)境中貯藏8 d。每隔24 h觀察果實發(fā)病情況，測量病斑直徑。

1.2.4 MeJA處理后果實內(nèi)防御酶活性測定

將挑選好的葡萄果實分成4組處理：(1)CK組：用蒸餾水浸泡10 min后，于25℃放置24 h；(2)MeJA處理組：用50 μmol/L MeJA溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80)浸泡10 min后，于25℃放置24 h；(3)B.cinerea接種組：用蒸餾水浸泡10 min后，于25℃放置24 h，再用微量進樣器注入10 μL濃度為1×106個/mL的B.cinerea孢子懸浮液；(4)MeJA+B.cinerea接種組：用50 μmol/L MeJA溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80)浸泡10 min后，于25℃放置24 h，再接種10 μL 1×106個/mL的B.cinerea孢子懸浮液。4 組處理完成后，將果粒裝入塑料盒中(175×135×76(mm)，盒蓋上有6個孔，直徑1 cm)，置于室溫(25℃±1℃)，相對濕度為60%～65%的環(huán)境中貯藏7 d。每24 h取樣，收集葡萄病斑周圍0.50 cm處健康果肉組織，液氮速凍后，于-80℃冰箱中保存。重復(fù)3次，每組約500個果實。

1.2.5 指標(biāo)測定

1.2.5.1 腐爛率

腐爛率(%)=(腐爛果實個數(shù)/果實總個數(shù))×100。

1.2.5.2 硬 度

采用GY-4型果實硬度計，測定探頭直徑為3 mm，刺入深度為10 mm，于果實赤道部位測定。每處理取10個果實，重復(fù)3次。單位以N表示。

1.2.5.3 可溶性固形物含量

隨機選取30粒葡萄果實，榨汁后過濾，采用PR-PAL-1型數(shù)顯糖度計測定，各處理重復(fù)測定6次，取平均值。單位以%表示。

1.2.5.4 可滴定酸含量

參照曹建康[16]方法。采用酸堿滴定法測定，單位用%表示。

1.2.5.5 發(fā)病率及病斑直徑

病斑直徑超過穿刺孔徑2 mm的記為病果；病斑直徑利用游標(biāo)卡尺進行十字交叉法測定，每個病斑測量3次，計算平均值。

1.2.5.6 相關(guān)酶活性

通過果實硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、自然腐爛率、損傷接種B.cinerea后發(fā)病率及病斑直徑的變化篩選出50 μmol/L MeJA處理組為較適宜濃度進行酶活性測定。

(1)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性參照Liu等[17]方法測定(U/g 鮮重)。

(2)幾丁質(zhì)酶(CHI)活性參照曹健康等[16]方法測定(U/g 鮮重)。

(3)β-1,3葡聚糖酶(GLU)活性參照曹健康等[16]方法測定(U/g 鮮重)。

(4)多酚氧化酶(PPO)活性參考曹健康等[16]方法測定(U/g 鮮重)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，使用Duncan多重比較檢驗法進行顯著性分析(P<0.05 為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA處理對紅地球葡萄果實自然腐爛率的影響

研究表明，各處理葡萄果實自然腐爛率隨貯藏時間的延長呈逐漸上升的趨勢，40～60 d快速上升。CK組和100 μmol/L MeJA處理組在10 d時開始出現(xiàn)腐爛，200 μmol/L MeJA處理組20 d出現(xiàn)腐爛，50 μmol/L MeJA處理組30 d出現(xiàn)腐爛。40 d時，CK組腐爛率為25.00%，分別是50、100和200 μmol/L MeJA處理組的2.82、1.30和1.04倍。60 d時，50、100和200 μmol/L MeJA處理組自然腐爛率分別比對照低了33.33%、21.79%和16.03%，整個貯藏期間，50 μmol/L MeJA處理組果實的自然腐爛率顯著低于CK組(P<0.05)。MeJA處理對紅地球葡萄果實腐爛具有抑制作用。圖1

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 MeJA處理對紅地球葡萄果實硬度的影響

研究表明，在貯藏期間果實硬度均呈下降趨勢，3種濃度MeJA處理組對果實硬度的影響差異較明顯。果實初始硬度為15.60 N，60 d時，CK組和50 μmol/L MeJA處理組硬度分別為8.60和11.20 N，降幅比例分別為44.87%和28.21%。在0～30 d期間，50 μmol/L MeJA處理組優(yōu)于100和200 μmol/L MeJA處理組，在30～60 d期間，MeJA 3個處理組無差異。整個貯期內(nèi)，50 μmol/L MeJA處理組與CK組在貯藏期間存在顯著性差異(P<0.05)。MeJA處理對果實硬度的下降有減緩作用。圖2

圖2 不同MeJA處理下紅地球葡萄果實硬度變化Fig.2 Effects of MeJA treatment at different concentrations on the hardness of grapes

2.3 MeJA處理對紅地球葡萄果實可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

研究表明，貯藏期間，CK組和處理組果實可溶性固形物含量隨貯藏時間的延長呈先上升后下降趨勢，各處理組果實在20 d時達到峰值，隨后緩慢降低，30 d后，各處理組果實可溶性固形物下降加快。在30～60 d期間，各MeJA處理組可溶性固形物含量均高于CK組，至60 d時，50、100和200 μmol/L MeJA處理果實可溶性固形物含量分別比CK組高15.44%、5.88%和4.41%，差異顯著(P<0.05)。

貯藏期間，CK組和處理組果實可滴定酸含量隨貯藏時間的延長呈緩慢下降趨勢，后期有小幅上升，總體變化不大。在10～40 d，50 μmol/L MeJA處理組可滴定酸含量高于CK組(P<0.05)，MeJA處理能延緩紅地球葡萄的可滴定酸含量的降低，其中50 μmol/L MeJA處理效果較好。圖3

注：(A)和可滴定酸(B)含量的影響

2.4 MeJA處理對葡萄果實采后損傷接種B. cinerea發(fā)病率和病斑直徑的影響

研究表明，不同濃度MeJA處理損傷接種的果實，在25℃條件下貯藏至第6 d時，50和200 μmol/L MeJA處理組發(fā)病率分別為59.96%和68.84%，與CK組相比，發(fā)病率分別降低了25.05%和13.95%，差異顯著(P<0.05)，而200 μmol/L MeJA處理組果實發(fā)病率與CK組無顯著差異。在25℃條件下貯藏至第6 d時，50 μmol/L MeJA處理組和CK組葡萄果實的病斑直徑分別為3.90和5.98 mm，50 μmol/L MeJA處理組病斑直徑較CK組降低了34.78%，50 μmol/L MeJA處理組與CK組差異顯著(P<0.05)；而100和200 μmol/L MeJA處理組果實發(fā)病率與CK組相比，無顯著差異。50 μmol/L MeJA處理能夠有效抑制發(fā)病率上升和果實病斑擴大，能提高葡萄果實對灰葡萄孢的抗性，對灰霉病害的控制效果顯著。圖4

圖4 MeJA不同濃度處理下葡萄果實發(fā)病率(A)和病斑直徑(B)變化(第6 d)Fig.4 Effects of different MeJA concentrations treatment on grape incidence (A) and lesion diameter (B) (No.6 d)

2.5 MeJA處理對損傷接種B. cinerea葡萄果實PAL活性的影響

研究表明，各處理組果實PAL活性隨貯藏時間的延長呈先上升后下降再上升的趨勢，各處理組在貯藏3～8 d時，PAL活性始終高于CK組(P<0.05)。經(jīng)接種B.cinerea果實的PAL活性在貯藏3 d達到峰值，為此時CK組的2.88倍。先經(jīng)MeJA處理后接種B.cinerea的葡萄果實PAL活性在貯藏前期快速增加，在貯藏2 d時出現(xiàn)明顯峰值，為CK組的5.31倍，并在之后的貯藏過程中顯著高于CK組果實(P<0.05)。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實接種B.cinerea后PAL活性的上升。圖5

圖5 不同MeJA處理下葡萄果實PAL活性變化Fig.5 Effects of MeJA treatment on PAL activity of grapes

2.6 MeJA處理對損傷接種B. cinerea葡萄果實CHI活性的影響

CHI活性總體上呈先上升后降低的變化趨勢，貯藏前后CK組無明顯變化。MeJA處理組、CK+B.cinerea接種組和MeJA+B.cinerea接種組果實CHI活性在貯藏2 d都有明顯升高，在第2 d時，各處理組均達到峰值，顯著高于CK組(P<0.05)。隨后各處理組CHI活性均開始下降，后期有緩慢升高，但各處理組在貯藏1～8 d的CHI活性始終高于CK組(P<0.05)。其中MeJA+B.cinerea接種組果實CHI活性在貯藏1 d時就被快速激活，貯藏2 d時達到峰值，為CK組的2.36倍，且貯藏期間其活性一直顯著高于其他3組果實(P<0.05)。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實接種B.cinerea后CHI活性的上升。圖6

圖6 不同MeJA處理下葡萄果實CHI活性變化Fig.6 Effects of MeJA treatment on CHI activity of grapes

2.7 MeJA對損傷接種B. cinerea葡萄果實GLU活性的影響

研究表明，貯藏前后CK組和各處理組果實GLU活性總體呈下降趨勢，各處理組在貯藏期間4～8 d的GLU活性始終高于CK組(P<0.05)。MeJA處理組果實的GLU活性在整個貯藏期間與CK組有顯著差異(P<0.05)。B.cinerea接種組和MeJA+B.cinerea接種組果實GLU活性均在貯藏4 d時達到峰值，分別為CK組的1.60和3.30倍(P<0.05)，整個貯藏期MeJA+B.cinerea接種組果實GLU活性在4組中均為最高。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實接種B.cinerea后GLU活性的上升。圖7

圖7 不同MeJA下葡萄果實GLU活性變化Fig.7 Effects of MeJA treatment on GLU activity of grapes

2.8 MeJA處理對損傷接種B. cinerea葡萄果實PPO活性的影響

研究表明，各處理組果實PPO活性總體呈先上升后降低的變化趨勢。MeJA處理組、B.cinerea接種組和MeJA+B.cinerea接種組果實PPO活性在貯藏前期都有顯著升高，于2 d到達活性高峰，分別為對照的1.29、1.11和1.61倍，隨后酶活性均開始下降，但始終高于CK組。貯藏1～8 d，MeJA+B.cinerea接種組果實PPO活性在4組中均為最高，顯著高于其他3組(P<0.05)。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實接種B.cinerea后PPO活性的上升。圖8

圖8 不同MeJA處理對葡萄果實PPO活性變化Fig.8 Effects of MeJA treatment on PPO activity of grapes

3 討 論

MeJA是一種外源非生物誘導(dǎo)因子，能充當(dāng)信號分子調(diào)控多種果實抗逆性反應(yīng)和次生代謝產(chǎn)物的合成，是植物獲得誘導(dǎo)抗性的重要誘導(dǎo)因子，它能誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生抵抗外界脅迫的防御反應(yīng)[18]。MeJA屬于植物體內(nèi)的信號分子，具有明顯的生理代謝活性，且無毒、無污染，可作為傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的替代物用于果蔬貯藏保鮮[19]。MeJA處理的葡萄果實腐爛率、硬度、可溶性固形物和可滴定酸含量與CK組相比，可顯著保持果實硬度，顯著延緩可溶性固形物和可滴定酸含量下降速度，延緩葡萄果實采后衰老速度，維持采后果蔬的品質(zhì)特性，延長其貯藏期。MeJA在改善果蔬采后品質(zhì)、延緩果蔬衰老中有重要作用，可延緩李[20]、冬棗[21]、獼猴桃[22]、火龍果[23]、菠蘿[24]和楊梅[25]等果實硬度的下降，抑制果實可溶性固形物和可滴定酸含量的下降，維持果實的營養(yǎng)品質(zhì)，延緩果實成熟和衰老進程。與實驗的研究結(jié)果相一致，外源MeJA處理在葡萄果實貯運保鮮中具有較好的應(yīng)用前景。

PPO活性的增強對于采后果實抗病性的增強具有重要作用。MeJA處理對冬棗果實貯藏品質(zhì)[21]、桃果實軟化[26]和鮮切紫薯病害的控制[27]，均與MeJA誘導(dǎo)了果實中PPO活性密切相關(guān)。與試驗結(jié)果一致，在研究中，采后MeJA處理明顯增強了葡萄果實PPO活性，可能是因為MeJA誘導(dǎo)了木質(zhì)素、植保素等抗性物質(zhì)的形成，增強酚類物質(zhì)氧化能力，生成對病原微生物有毒性作用的醌類物質(zhì)，直接抑制病原菌的侵染[28]。

PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。植物受到病原菌侵染后，會在感染部位誘導(dǎo)和積累大量PR蛋白使SAR，這就包括CHI和GLU[29]。研究發(fā)現(xiàn)MeJA+B.cinerea接種處理較單一的MeJA處理或B.cinerea接種處理更顯著地誘導(dǎo)了葡萄果實PAL、CHI、GLU和PPO活性的上升，使得這幾個酶活性在整個貯藏期間都維持在最高水平，表明MeJA處理可誘導(dǎo)提高采后葡萄果實的抗病性，并且只有在病原菌侵染后才表現(xiàn)出更強的抗病反應(yīng)，推測MeJA可能是通過Priming機制誘導(dǎo)葡萄果實的抗病性，從而有效抑制灰霉病的發(fā)生。與MeJA誘導(dǎo)的鱷梨對Colletotrichumgloeosporioides引起的炭疽病抗性[30]及楊梅對Penicilliumcitrinum侵染的抗性[31]相關(guān)酶(CHI、GLU和PAL)活性增強的研究結(jié)果一致。但MeJA對病害控制的分子機理尚不清楚，有待后續(xù)實驗進一步研究。

4 結(jié) 論

50 μmol/L MeJA為最適宜葡萄采后處理濃度。MeJA處理能夠顯著提高葡萄PAL、CHI、GLU和PPO等抗性酶的表達及活性以及對灰葡萄孢顯著的誘導(dǎo)抑制能力。MeJA處理可延緩果實硬度的下降，維持葡萄果實中可溶性固形物和可滴定酸含量，抑制果實的腐爛，延緩葡萄果實采后衰老進程，對于提高果實的采后抗病性和貯藏品質(zhì)，延長果實的貨架期效果顯著。