高溫悶棚對設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲的防治效果及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

何 偉，羅文芳，于鎮(zhèn)華,許建軍，孫曉軍

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，哈爾濱 150081)

0 引 言

【研究意義】根結(jié)線蟲是一種高度?；偷闹参锊≡€蟲，近年來，隨著設(shè)施蔬菜種植面積的增加，根結(jié)線蟲病已成為嚴(yán)重威脅新疆設(shè)施蔬菜生產(chǎn)的一種重要土傳病害[1]。研究高溫悶棚對蔬菜根結(jié)線蟲和根際土壤微生物群落的影響。對研究適宜本地的綠色防控技術(shù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，蔬菜生產(chǎn)上防治根結(jié)線蟲方法有抗病品種[2]、嫁接栽培技術(shù)[3]、農(nóng)業(yè)防治[4]、生物防治[5-6]和化學(xué)防治[7-8]，其中以化學(xué)防治為主。但化學(xué)藥劑造成蔬菜品質(zhì)下降、環(huán)境污染及人體健康的問題日益突出。高溫悶棚作為一種有效的防治病害的措施被廣泛應(yīng)用，如高溫悶棚防治黃瓜霜霉病[9]、白粉病[10]、西瓜枯萎病[11]、茄子黃萎病[12]、根結(jié)線蟲病[13]及消除土壤連作障礙[14]等已有相關(guān)報道。高溫悶棚不僅可以有效殺滅溫室中的病原微生物，其對土壤微生物群落也會產(chǎn)生影響。李佳川[15]報道，灌水高溫悶棚處理后，土壤微生物區(qū)系表現(xiàn)為細菌及放線菌含量升高，真菌含量降低。宋健等[16]報道日曬高溫覆膜對韭菜根際土壤微生物多樣性無顯著影響。何志剛等[17]研究表明，高溫悶棚是否淹水是影響土壤微生物群落劃分的主要因素。【本研究切入點】長期以來，新疆設(shè)施蔬菜種植戶在夏季高溫時僅采用扣棚方式悶棚，但此方法地溫達不到殺死根結(jié)線蟲的溫度。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究新疆高溫干旱區(qū)溫室灌水+覆膜、灌水+覆膜+藥劑及灌水未覆膜高溫悶棚處理對土壤根結(jié)線蟲及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響，為新疆區(qū)域高溫悶棚防治根結(jié)線蟲提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

10%噻唑膦顆粒劑(日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社)、10.2%阿維·噻唑啉顆粒劑(江西眾合化工有限公司)、5%阿維菌素乳油(江西眾合化工有限公司)。自計式土壤溫度記錄儀，型號：L93-3(杭州路格科技有限公司)。

試驗于2019年7～8月在吐魯番市高昌區(qū)亞爾鄉(xiāng)建設(shè)七隊溫室進行。試驗溫室結(jié)構(gòu)為干打壘溫室，長120 m，寬8 m。在上茬番茄拉秧后，及時清除病殘體，鏟除田間雜草，帶出棚外深埋，保持棚架完好，棚膜完整，無破損。均勻撒施雞糞在土壤表面，用量4 000 kg/667m2，深翻25～30 cm。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置在同一個溫室中，6個處理，每處理140 m2，3次重復(fù)，小區(qū)長20 m，寬7 m。10%噻唑膦顆粒劑和10.2%阿維·噻唑膦顆粒劑各0.42 kg分別與細土混勻后均勻撒于土壤表面，5%阿維菌素乳油稀釋3 000倍，均勻噴灑于土壤表面，采用旋耕機進行土壤深耕。每處理四周做壩，灌水，水面高出地面3～5 cm，蓋好厚度為0.08 mm舊棚膜，四周用土壓嚴(yán)實，扣棚進行悶棚處理24 d，悶棚結(jié)束后進行耕翻，晾曬15 d后直播生菜。

在高溫悶棚后增施生物菌肥。在直播生菜第1次灌水時，將微生物菌劑寧盾一號A型隨水沖施，用量為10 L/667m2，第2次灌水時，5L/667m2。表1

表1 處理方法Table 1 Test treatment method

1.2.2 測定指標(biāo)

1.2.2.1 土壤溫度監(jiān)測

采用自計式土壤溫度計(溫度記錄間隔5 min)記錄土壤溫度變化情況，覆膜后將土壤溫度計插入土壤，探頭插入深度分別為10、20、30 cm土壤中，悶棚結(jié)束后，取回溫度記錄儀，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入計算機，使用Excel分析數(shù)據(jù)。

1.2.2.2 土壤樣品采集

悶棚前、后和生菜收獲期，分別采用取土器取深度0～20 cm土壤，每處理隨機取10個點，混勻后部分土壤用于檢測根結(jié)線蟲數(shù)量，部分土壤-20℃保存用于微生物檢測。悶棚前處理1～6土壤樣本編號為A1～A6，悶棚后處理1～6土壤樣本編號為B1～B6，生菜采收期處理1～6土壤樣本編號為C1～C6。

1.2.2.3 土壤理化性質(zhì)

將采集的土壤樣品進行處理，經(jīng)自然風(fēng)干、研磨過篩(1 mm)后，測定土壤的理化性質(zhì)。速效氮采用堿解擴散法，速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀采用1 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法，pH值采用pH計按土水比1∶2.5測定。

1.2.2.4 土壤根結(jié)線蟲數(shù)量

采用淺盤分離法與漏斗分離法分離線蟲，具體步驟如下：取一根橡皮管，一端用夾子夾住，另一端連接漏斗，放在漏斗架上，在100目的標(biāo)準(zhǔn)沖篩框上墊1張面巾紙，裝入稱好的100 g土樣，鋪平，往漏斗內(nèi)加水，水漫過土壤約0.5 cm左右，靜置24 h后，松開止水夾，將漏斗中水緩慢放入小燒杯內(nèi)，最后在體視顯微鏡下統(tǒng)計根結(jié)線蟲2齡幼蟲的數(shù)量。

1.2.2.5 土壤微生物 DNA 提取及高通量測序

根據(jù)FastDNA?Spin Kit for Soil 試劑盒的操作步驟提取土壤微生物總 DNA，PCR 所用的細菌引物為V3-V4 通用引物，338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[18]；真菌引物為通用引物，ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′[19]，微生物擴增子高通量測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理土壤溫度監(jiān)測

研究表明，灌水+覆膜處理10、20和30 cm深土壤最高溫度分別為60.1、53.5和46.6℃，持續(xù)時間為50 min；灌水未覆膜處理分別為55、46.8和43.2℃，持續(xù)時間為45 min；空白對照分別為48、48.3和41.3℃，持續(xù)時間為40 min。灌水+覆膜可以增加土壤溫度，且高溫持續(xù)時間長。圖1

圖1 不同土壤深度的溫度變化Fig. 1 Temperature changes in different soil depths

2.2 不同時期各處理土壤根結(jié)線蟲檢測

研究表明，悶棚后灌水+覆膜+藥劑和灌水+覆膜處理土壤根結(jié)線蟲蟲口減退率100%，灌水未覆膜蟲口減退率為83.1%。生菜采收期，各處理均無根結(jié)線蟲危害，灌水+覆膜+藥劑和灌水+覆膜處理土壤根結(jié)線蟲蟲口減退率在99%以上，灌水未覆膜處理蟲口減退率69.4%。表2

表2 不同處理對土壤根結(jié)線蟲防治效果比較Table 2 Comparison of control effects of different treatments on soil root-knot nematodes

2.3 不同時期各處理土壤養(yǎng)分差異

研究表明，高溫悶棚后較悶棚前，處理1～4土壤速效氮含量無顯著差異性，處理5和6顯著下降；處理1～5土壤速效磷含量顯著增加，處理6無顯著差異；處理1～6土壤速效鉀含量顯著降低；處理1和5土壤pH值顯著下降，其他處理無顯著差異。生菜采收期較高溫悶棚后，處理1～4土壤速效氮含量無顯著差異，處理5和6顯著增加；處理1～6土壤速效磷含量顯著下降；處理1～6土壤速效鉀含量顯著增加；處理1土壤pH值顯著增加，其他處理無顯著差異。圖2

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)。A為悶棚前；B為悶棚后；C為生菜采收期

2.4 樣品間Beta 多樣性

研究表明，細菌主成分 1(PC1)、主成分 2 (PC2)的樣品差異性貢獻率分別為 37.07%、14.99%，合計達到52.06%。真菌主成分 1(PC1)、主成分 2 (PC2)的樣品差異性貢獻率分別為 17.72%、15.03%，合計達到22.75%。高溫悶棚前、后和生菜采收期3個時間點土壤樣本距離均較遠，3個時間點土壤中真菌、細菌組成成分均存在顯著差異；悶棚前、后和生菜采收期中每個時期6個處理土壤樣本距離較近，每個時期土壤中真菌、細菌組成成分相近。圖3

2.5 對土壤微生物多樣性的影響

研究表明，悶棚前、后和生菜采收期6個不同處理分別得到1 280 147、1 280 147和1 118 042條有效序列。Coverage測序深度指數(shù)均大于99.7%，表明測序深度已基本上覆蓋到樣品中所有的物種。高溫悶棚后，灌水+覆膜+阿維菌素土壤中的真菌物種豐度和多樣性均減少；空白對照土壤中真菌物種豐度下降，但真菌物種多樣性增加；其他4個處理土壤真菌物種豐度和多樣性均增加。生菜采收期真菌物種豐度增加，但真菌物種多樣性下降。表3

悶棚前、后和下茬生菜采收期6個不同處理分別得到1 127 237、818 676和989 102條有效序列。Coverage測序深度指數(shù)均大于97.5%，表明測序深度已經(jīng)覆蓋到測試樣品中大部分物種。結(jié)果表明，高溫悶棚后，6個處理土壤樣本中細菌物種豐度和多樣性均較高溫悶棚前下降，生菜采收期，細菌物種豐度和多樣性均較高溫悶棚后上升。表4

注:A是細菌；B是真菌。A01～A06是悶棚前處理1～6；B01～B06是悶棚后處理1～6；C01～C06是生菜采收期處理1～6。下同

2.6 門水平上真菌群落結(jié)構(gòu)

研究表明，不同時期各處理土壤樣本中真菌優(yōu)勢菌門有顯著差別。高溫悶棚后較悶棚前，6個處理土壤中被孢霉門豐度顯著下降，處理1和6擔(dān)子菌門豐度顯著下降，其他處理擔(dān)子菌門豐度顯著增加。生菜采收期，處理6被孢霉門豐度較高溫悶棚后無顯著差異，其他各處理的被孢霉門豐度顯著降低。圖4

圖4 門水平上真菌樣本的群落組成Fig. 4 The community abundance analysis of fungal genes at the phylum level

2.7 門水平上細菌群落結(jié)構(gòu)

研究表明，高溫悶棚后，處理1和6土壤樣本中變形菌門Proteobacteria豐度增加，異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus豐度無顯著變化，其他處理變形菌門豐度下降，異常球菌-棲熱菌門豐度增加。6個處理土壤樣本中芽單胞菌門Gemmatimonadetes、酸桿菌門Acidobacteria、硝化螺旋菌門Nitrospirae和浮霉菌門Planctomycetes豐度顯著降低，厚壁菌門Firmicutes豐度顯著增加；處理1土壤樣品中綠彎菌門Chloroflexi豐度下降，其他處理綠彎菌門豐度增加。

生菜采收期較高溫悶棚后，處理1和6土壤樣品中變形菌門豐度下降，其他處理豐度增加；處理1綠彎菌門豐度增加，其他處理綠彎菌門豐度下降；6個處理擬桿菌門豐度顯著增加；處理6厚壁菌門豐度無顯著變化，其他處理厚壁菌門豐度顯著降低。圖5

表3 真菌的多樣性指數(shù)Table 3 The analysis of alpha diversity estimators of fungi

表4 細菌的多樣性指數(shù)Table 4 The analysis of alpha diversity estimators of bacteria

圖5 門水平上細菌樣本的群落組成Fig.5 The community abundance analysis of bacteria genes at the phylum level

2.8 屬水平上真菌群落結(jié)構(gòu)

研究表明，高溫悶棚后較悶棚前，處理1和6土壤樣品中鏈格孢屬Alternaria和枝孢屬Cladosporium豐度變化小，被孢霉屬Mortierella豐度增加，其他處理鏈格孢屬和枝孢屬豐度增加，被孢霉屬豐度無顯著變化。生菜采收期較高溫悶棚后， 6個處理被孢霉屬和曲霉屬Aspergillus豐度均下降；處理2、3、4鏈格孢屬豐度增加，處理5、6翅孢殼屬Emericellopsis豐度增加。圖6

圖6 屬水平上真菌樣本的群落組成Fig.6 The community abundance analysis of fungal genes at the genus level

2.9 屬水平上細菌群落結(jié)構(gòu)

研究表明，高溫悶棚后較悶棚前，6個處理uncultured_bacterium_f._Gemmatimonadaceae、芽單胞菌屬Gemmatimonas、RB41和uncultured_bacterium_f_Rhodospirillaceae豐度下降，芽孢桿菌屬Bacillus、uncultured_bacterium_f_Longimicrobiaceae和亞棲熱菌屬Meiothermus豐度增加；處理1和6鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas豐度增加，uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group豐度下降，其他4個處理鞘氨醇單胞菌屬豐度下降，uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group豐度增加。生菜采收期較高溫悶棚后，處理5uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae豐度下降，其他處理豐度增加；處理1和6鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas和亞棲熱菌屬Meiothermus豐度下降，其他處理豐度增加；處理6芽孢桿菌屬Bacillus豐度增加，其他處理豐度下降；處理1芽單胞菌屬Gemmatimonas豐度略有下降，其他處理豐度增加；6個處理uncultured_bacterium_f_Longimicrobiaceae豐度下降，黃桿菌屬Flavobacterium豐度增加。圖7

圖7 屬水平上細菌樣本的群落組成Fig.7 The community abundance analysis of bacteria genes at the genus level

3 討 論

3.1 不同處理高溫悶棚對土壤根結(jié)線蟲防治效果

研究表明，新疆吐魯番溫室采用僅扣棚的傳統(tǒng)悶棚方法，土壤溫度達不到對根結(jié)線蟲致死溫度，灌水+覆膜后再扣棚的高溫悶棚方法，10 cm深土壤溫度可達60℃以上且可持續(xù)50 min。15～30℃是根結(jié)線蟲的適宜生長繁殖溫度，40℃以上高溫和5℃以下低溫即可抑制2齡幼蟲存活和卵囊中卵孵化，雌蟲不能發(fā)育完全[20]。根結(jié)線蟲主要分布在0～30 cm的表層土壤內(nèi)，該蟲在55℃的溫度條件下，經(jīng)8～10 min即可致死[21]。研究與前人研究結(jié)果一致，為改變新疆吐魯番溫室高溫悶棚方式提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2 高溫悶棚對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

溫度是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主要因子之一。溫度升高增加了土壤中真菌豐度，促進了土壤對菌類中一些酶的利用效率，影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)已報道[22]。有報道平均1.17℃的土壤升溫使土壤微生物PLFAs總量增加34.58%，升溫使細菌相對含量增加8.80%，而使真菌相對含量降低17.48%[23]?；馂?zāi)引起的高溫致使土壤細菌下降了16%，真菌和放線菌數(shù)量分別下降了3%和2%[24]。研究中前茬作物是辣椒，高溫悶棚后土壤真菌物種豐度增加，細菌物種豐度和多樣性均較高溫悶棚前下降。不同區(qū)域土壤理化性質(zhì)和種植作物的不同及土壤溫度的高低、持續(xù)時間，可能是造成研究者研究結(jié)果差異的原因。

目前設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲的防治仍然以化學(xué)防治為主，但其毒性高、易污染環(huán)境。秸稈生物反應(yīng)堆技術(shù)[25]、石灰氮消毒[26]、生物菌肥[27]和高溫悶棚[13]等綠色防控技術(shù)多有報道。但由于各單項技術(shù)在不同區(qū)域?qū)ΩY(jié)線蟲防治效果不同，因此，選擇適宜區(qū)域的防治技術(shù)尤為重要。研究中高溫悶棚后灌水+覆膜和灌水+覆膜+藥劑處理的根結(jié)線蟲蟲口減退率均為100%。高溫悶棚后需要及時補充有益微生物，篩選適宜新疆本地堿性土壤環(huán)境的微生物需要進一步研究。

4 結(jié) 論

新疆吐魯番區(qū)域溫室采用灌水+覆膜后再扣棚的悶棚方法，10 cm深土壤溫度可達60℃以上且可持續(xù)50 min，根結(jié)線蟲減退率為100%；悶棚后土壤真菌物種豐度增加，細菌物種豐度和多樣性均下降，土壤中鏈格孢屬、枝孢屬真菌和uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group細菌含量增加，鞘氨醇單胞菌屬含量降低。新疆吐魯番及南疆溫室蔬菜種植區(qū)域適宜推廣灌水+覆膜的高溫悶棚方式。