lncRNA PURPL通過(guò)調(diào)控miR-367-3p/MTA3軸抑制腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲

楊凌博，孫建濤，魯帥奇，武新超，李小輝

腎癌的發(fā)病率在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中位居第2位，是常見(jiàn)的腎臟惡性腫瘤[1]。早期腎癌的治療取得較大進(jìn)展，然而中晚期腎癌的療效依然較差，腎癌細(xì)胞高度增殖活性及侵襲導(dǎo)致中晚期腎癌患者預(yù)后不良[2-3]。目前，腎癌增殖和侵襲的機(jī)制尚不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄合成，在腎癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起決定性作用[4-5]。PURPL是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，參與調(diào)控肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)高低與腫瘤的大小和組織學(xué)分級(jí)相關(guān)[6-8]。PURPL在腎癌組織中的表達(dá)水平、具體作用及調(diào)控機(jī)制尚待闡明。本文旨在探討PURPL在腎癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，明確PURPL通過(guò)調(diào)控miR-367-3p/MTA3分子軸對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，為尋找新的腎癌治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2018年1月～2020年8月我院泌尿外科手術(shù)切除的67例腎癌組織，均為腎透明細(xì)胞癌。其中男性39例，女性28例；年齡26～83歲，平均63.23歲。根據(jù)2010年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期43例，Ⅱ期23例；根據(jù)Fuhrman組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)23例，Ⅱ級(jí)29例，Ⅲ級(jí)9例，Ⅳ級(jí)6例。另收集距離腫瘤邊緣>2 cm的癌旁組織作為對(duì)照。腫瘤組織和癌旁組織均經(jīng)兩名以上病理醫(yī)師證實(shí)，標(biāo)本均凍存于液氮，患者術(shù)前均無(wú)放、化療及免疫治療史。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2細(xì)胞與試劑 腎癌細(xì)胞系和正常腎小管上皮細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。陰性對(duì)照慢病毒、PURPL慢病毒、miR-367-3p mimic、miR-NC mimic、PURPL野生型報(bào)告基因(PURPL-WT)與突變型報(bào)告基因(PURPL-MUT)，均購(gòu)于上海吉瑪公司。TRIzol試劑和Lipofectamine 2000，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。MTT試劑盒購(gòu)于南京凱基公司。qRT-PCR試劑盒和引物，購(gòu)于南京建成生物研究所。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Promega公司。一抗(MTA3、Cyclin A、CDK2、Zeb-2、GAPDH、Snail)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 ACHN、786-O、A498、Caki-1、OS-RC-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，HK-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。OS-RC-2細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，胰酶消化并接種到6孔板，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組和PURPL組分別感染陰性對(duì)照慢病毒和PURPL慢病毒，感染復(fù)數(shù)(MOI)均為40；感染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)PURPL、miR-367-3p與MTA3 mRNA的表達(dá) 采用TRIzol試劑提取組織及細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)建立反應(yīng)體系，以GAPDH和U6作為內(nèi)參照。qRT-PCR檢測(cè)PURPL正向引物：5’-TTCTACCGCAATTCGATGGAGTCTTG-3’，反向引物：5’-GAGGCAGGAGAATGGCGTGA-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-367-3p正向引物：5’-CGAGCAATTGCACTTTAGCAAT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH正向引物：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，反向引物：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’；MTA3正向引物：5’-TCCTCCAGCAACCCATACCT-3’，反向引物：5’-TCGGTCAAGTCAGCCTCAAC-3’。qRT-PCR運(yùn)行參數(shù)：95 ℃ 50 s，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，合計(jì)35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算PURPL、miR-367-3p和MTA3 mRNA表達(dá)水平。

1.2.3MTT法檢測(cè)OS-RC-2細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OS-RC-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×104個(gè)細(xì)胞，取150 μL細(xì)胞懸液加入96孔板。取20 μL MTT試劑加入每孔，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)基后，取120 μL二甲基亞砜加入各孔，利用振蕩器充分振蕩。利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量每孔光密度(OD)值。每天檢測(cè)OS-RC-2細(xì)胞活力，連續(xù)檢測(cè)5天。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OS-RC-2細(xì)胞侵襲 在Transwell小室預(yù)鋪基質(zhì)膠，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OS-RC-2細(xì)胞密度至每毫升1×105個(gè)細(xì)胞，取150 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室，取550 μL含胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室并用棉簽擦去未穿過(guò)上室的細(xì)胞，利用甲醇進(jìn)行固定，利用結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，流水清洗并晾干，顯微鏡(×100)下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.5生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證PURPL的潛在分子機(jī)制 利用starBase v 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PURPL結(jié)合的miRNA。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OS-RC-2細(xì)胞接種至96孔板，根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將PURPL-WT與PURPL-MUT及miR-367-3p mimic或miR-NC mimic共轉(zhuǎn)染至OS-RC-2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)OS-RC-2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.6Western blot法檢測(cè)MTA3蛋白表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OS-RC-2細(xì)胞，利用RIPA裂解液提取總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。在5%脫脂牛奶中封閉，加入一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育3 h，配置ECL試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 腎癌和癌旁組織中PURPL的表達(dá)水平PURPL在腎癌和癌旁組織中表達(dá)分別為0.40±0.14和1.61±0.21，癌旁組織的PURPL表達(dá)是腎癌組織的4.03倍，明顯高于腎癌組織(P<0.01，圖1)。

圖1 腎癌組織和癌旁組織中PURPL表達(dá)水平

2.2 腎癌細(xì)胞和正常腎小管上皮細(xì)胞中PURPL表達(dá)水平腎癌ACHN、786-O、A498、Caki-1、OS-RC-2細(xì)胞中PURPL的表達(dá)分別為0.53±0.08、0.66±0.06、0.41±0.03、0.77±0.05、0.13±0.03，明顯低于正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2(1.00±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，圖2)，OS-RC-2細(xì)胞中PURPL表達(dá)水平最低(P<0.01)，故選擇OS-RC-2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 腎癌細(xì)胞和正常腎小管上皮細(xì)胞中PURPL表達(dá)水平

2.3 對(duì)照組和PURPL組OS-RC-2細(xì)胞中PURPL的表達(dá)水平熒光顯微鏡顯示慢病毒感染成功。qRT-PCR結(jié)果顯示，PURPL組和對(duì)照組OS-RC-2細(xì)胞中PURPL表達(dá)分別為16.26±3.10和1.02±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)，表明PURPL過(guò)表達(dá)成功。

圖3 OS-RC-2細(xì)胞中PURPL的表達(dá)水平：A.對(duì)照組(普通顯微鏡)；B.PURPL組(普通顯微鏡)；C.對(duì)照組(熒光顯微鏡)；D.PURPL組(熒光顯微鏡)

2.4 過(guò)表達(dá)PURPL對(duì)OS-RC-2細(xì)胞增殖活力的影響MTT法結(jié)果顯示，48 h后PURPL組OS-RC-2細(xì)胞增殖活力明顯低于對(duì)照組(P<0.05，圖4)。

圖4 MTT檢測(cè)PURPL對(duì)OS-RC-2細(xì)胞增殖活力的影響

2.5 過(guò)表達(dá)PURPL對(duì)OS-RC-2細(xì)胞侵襲的影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組和PURPL組OS-RC-2細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(71.53±6.23)個(gè)和(26.87±3.88)個(gè)；與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)PURPL可明顯抑制OS-RC-2細(xì)胞侵襲(P<0.01，圖5)。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PURPL對(duì)OS-RC-2細(xì)胞侵襲能力的影響：A.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PURPL對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲的影響；B.細(xì)胞侵襲數(shù)的半定量分析

2.6 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證PURPL的潛在機(jī)制利用starBase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-367-3p可能是PURPL的靶基因(圖6)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)共轉(zhuǎn)染miR-367-3p mimic和靶向位點(diǎn)無(wú)突變的PURPL-WT載體使OS-RC-2細(xì)胞中熒光素酶活性明顯下降(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染miR-367-3p mimic和靶向位點(diǎn)突變的PURPL-MUT載體對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著作用(P>0.05，圖7)，提示miR-367-3p是PURPL的靶基因。

圖6 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)PURPL的潛在機(jī)制

圖7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-367-3p和PURPL的靶向關(guān)系

2.7 過(guò)表達(dá)PURPL的OS-RC-2細(xì)胞中miR-367-3p和MTA3 mRNA表達(dá)變化qRT-PCR檢測(cè)顯示，對(duì)照組和PURPL組OS-RC-2細(xì)胞miR-367-3p的表達(dá)分別為1.04±0.16和0.23±0.08，過(guò)表達(dá)PURPL顯著下調(diào)miR-367-3p的表達(dá)(P<0.01)。對(duì)照組和PURPL組OS-RC-2細(xì)胞MTA3 mRNA的表達(dá)分別為1.01 ± 0.06和5.49 ± 1.16，過(guò)表達(dá)PURPL顯著上調(diào)MTA3 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

2.8 過(guò)表達(dá)PURPL促進(jìn)MTA3蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PURPL后OS-RC-2細(xì)胞中MTA3蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞增殖蛋白如Cyclin A、CDK2表達(dá)明顯降低，細(xì)胞侵襲蛋白如Zeb-2、Snail表達(dá)明顯降低，提示OS-RC-2細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯降低(圖8)。

圖8 Western blot法檢測(cè)MTA3蛋白及細(xì)胞功能蛋白的表達(dá)：A.Western blot實(shí)驗(yàn)；B.蛋白表達(dá)灰度值分析

3 討論

lncRNA參與調(diào)控染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄抑制及激活、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)韧緩剑绊懟虻谋磉_(dá)[9]。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，lncRNA已成為腎癌研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[10]。最新文獻(xiàn)報(bào)道，lncRNA是腎癌增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子[11-12]。Cai等[13]研究表明，lncRNA PCGEM1主要位于細(xì)胞質(zhì)，其在腎癌細(xì)胞中表達(dá)升高，沉默lncRNA PCGEM1可抑制腎癌的細(xì)胞增殖和遷移，miR-433-3p是lncRNA PCGEM1的靶基因。Hu等[14]研究表明，MSC-AS1在腎癌組織中顯著上調(diào)，與腎癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，降低MSC-AS1表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)miR-3924表達(dá)抑制腎癌細(xì)胞的增殖和遷移特性。lncRNA在不同腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)為不同的表達(dá)模式，因此在不同腫瘤細(xì)胞中的作用不同[15]。研究發(fā)現(xiàn)，PURPL能夠顯著調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[8]。目前，PURPL在腎癌中的表達(dá)、功能及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本組發(fā)現(xiàn)在腎癌組織和細(xì)胞系中PURPL的表達(dá)明顯下調(diào)，上調(diào)PURPL能夠抑制腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲，提示PURPL在腎癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌功能。

lncRNA可特異性與相應(yīng)miRNA互補(bǔ)結(jié)合，發(fā)揮“分子海綿”作用，抑制miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)控作用[16-17]。本組采用starBase v2.0預(yù)測(cè)顯示，PURPL與miR-367-3p存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證PURPL共價(jià)靶向miR-367-3p。最近研究表明，miR-367-3p在非小細(xì)胞癌、骨肉瘤、腎透明細(xì)胞癌等多種腫瘤中高表達(dá)，顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮明顯的癌基因功能[18-19]。miR-367-3p在腎癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)增加，下調(diào)miR-367-3p顯著抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，MTA3基因是miR-367-3p在腎癌中的直接靶基因[20]。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，上調(diào)PURPL可顯著抑制miR-367-3p的表達(dá)，miR-367-3p表達(dá)下調(diào)可顯著促進(jìn)MTA3基因的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PURPL可能作為miR-367-3p的“分子海綿”調(diào)節(jié)MTA3基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腎癌的發(fā)生、發(fā)展。Western blot結(jié)果顯示，上調(diào)PURPL后細(xì)胞增殖蛋白如Cyclin A、CDK2表達(dá)顯著減少，細(xì)胞侵襲蛋白如Zeb-2、Snail表達(dá)顯著減少，提示OS-RC-2細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯降低。PURPL在體內(nèi)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響尚不明確，本課題組下一步將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)PURPL在體內(nèi)的作用進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，lncRNA PURPL在腎癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，PURPL通過(guò)下調(diào)miR-367-3p促使MTA3表達(dá)上調(diào)，從而抑制腎癌OS-RC-2細(xì)胞的增殖和侵襲。PURPL/miR-367-3p/MTA3軸有望成為腎癌治療的標(biāo)志物和有效靶點(diǎn)。