肺腺癌中HMGB1的表達及意義

王曉敏，高增艷

肺癌的發(fā)病率及病死率位居惡性腫瘤的首位，腺癌是肺癌最常見的組織學分型。盡管靶向藥物已應用于臨床治療，但是非小細胞肺癌患者復發(fā)后5年生存率仍較低(約20%)[1]，癌細胞轉移是抗腫瘤治療的主要難點。近年研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在肝癌、卵巢癌等中高表達，并與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可以促進腫瘤的遷移和侵襲能力，HMGB1在肺腺癌中的表達及與EMT的關聯(lián)尚不明確。因此，本文采用免疫組化法檢測肺腺癌中HMGB1及EMT表型蛋白(E-cadherin、N-cadherin、vimentin)的表達，探討兩者的相關性，為臨床治療及預后評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年1～12月濰坊醫(yī)學院附屬益都中心醫(yī)院手術切除的新鮮肺腺癌組織和癌旁正常肺組織20例。收集2019年1月～2020年6月濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院和濰坊醫(yī)學院附屬益都中心醫(yī)院手術切除的肺腺癌組織90例和癌旁正常肺組織30例。臨床病理資料包括患者年齡、性別、吸煙史、遠處轉移、淋巴結轉移及TNM分期。所有患者術前均未行任何治療。

1.2 試劑RNA穩(wěn)定劑、Trizol試劑盒及Qiagen 74134 RNeasy Plus Mini Kit試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。鼠抗人單克隆抗體E-cadherin(4A2C7)、N-cadherin(D-4)及vimentin(SP20)，均購自福州邁新公司。鼠抗人單克隆抗體HMGB1(1D5)，購自武漢艾美捷科技公司。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 新鮮標本置于RNA穩(wěn)定劑RNA later中2 ℃保存?zhèn)溆谩NA提?。河肨rizol試劑提取組織中的總RNA，RNeasy Plus Mini Kit試劑盒純化RNA。熒光染料嵌合法(SYBR Green I)和StepOnePlus qRT-PCR反應體系(美國應用生物系統(tǒng)公司)進行實時PCR檢測。用2-ΔΔCt方法和GAPDH水平為基線對結果進行標準化校正處理。HMGB1引物序列：上游5′-TGTGCAAACTTGTCGGGAG-3′，下游5′-TCTTTCATAACGGGCCTTGTC-3′。

1.3.2免疫組化 將4 μm厚的肺腺癌組織切片烤制1 h，使用BenchMark XT全自動免疫組化染色機(美國羅氏)進行染色，脫水封固，光鏡下判讀。HMGB1、E-cadherin、N-cadherin和vimentin均設陰、陽性對照。

結果判定：E-cadherin、N-cadherin和vimentin陽性著色均定位于細胞膜及細胞質，HMGB1陽性著色定位于細胞核。(1)根據(jù)陽性細胞染色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽性細胞百分比計分：陰性為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述兩項得分之和即為腫瘤細胞的染色評分，其中0～4分為陰性，5～7分為陽性[2]。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間率的比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新鮮肺腺癌及配對正常肺組織中HMGB1 mRNA的表達新鮮肺腺癌組織中HMGB1 mRNA高表達13例(13/20, 65%)；其在癌旁正常肺組織中低表達，肺腺癌組織中HMGB1 mRNA的相對表達水平高于癌旁正常肺組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中HMGB1mRNA的相對表達水平

2.2 肺腺癌組織中E-cadherin、N-cadherin、vimentin及HMGB1蛋白的表達本組90例肺腺癌組織中vimentin陽性41例(41/90, 45.6%，圖2A)，陰性49例(49/90, 54.4%)；E-cadherin陽性49例(49/90, 54.4%)，陰性41例(41/90, 45.6%，圖2B)；N-cadherin陽性43例(43/90, 47.8%)，陰性47例(47/90, 52.2%)。以E-cadherin和(或)N-cadherin陽性、vimentin陰性表征為上皮型，即EMT陰性；反之為間質型，即EMT陽性。本組肺腺癌組織中EMT的發(fā)生率為45.6%，癌旁正常肺組織EMT均陰性(0)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肺腺癌組織中HMGB1陽性55例(55/90, 61.1%)(圖2C)，癌旁正常肺組織中HMGB1陽性6例(6/30, 20%)，HMGB1在肺腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁正常肺組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 肺腺癌組織中各蛋白的表達，EnVision法：A.vimentin陽性；B.E-cadherin陰性；C.HMGB1陽性

2.3 肺腺癌組織中EMT、HMGB1的表達與臨床病理特征的關系肺腺癌組織中EMT發(fā)生率及HMGB1陽性率在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期(59%)組高于Ⅰ+Ⅱ期組(32.6%)；有淋巴結轉移組(62.9%)高于無淋巴結轉移組(34.5%)；有遠處轉移組(60.6%)高于無遠處轉移組(36.8%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。EMT發(fā)生率及HMGB1陽性率與患者性別、年齡和有無吸煙史均無相關性(P均>0.05，表1)。

表1 肺腺癌中EMT、HMGB1與臨床病理特征的關系

2.4 HMGB1表達與EMT的相關性Spearman相關性分析顯示，肺腺癌組織中HMGB1表達與EMT之間具有相關性(χ2=4.608，P1=0.032，r=0.226，P2=0.032)，提示兩者呈正相關(表2)。

表2 HMGB1表達與EMT的相關性

3 討論

目前，分子靶向治療已成為非小細胞肺癌的一線治療方法，其中應用最廣泛的是EGFR-TKIs，患者無進展生存期明顯延長，但仍有20%的EGFR突變患者對靶向藥物存在原發(fā)性耐藥[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌細胞發(fā)生EMT與EGFR-TKIs耐藥密切相關，EMT是一個復雜的分子過程，是細胞從上皮細胞轉化為間充質狀態(tài)的過程，動物的許多生理和病理過程均與EMT有關，涉及非常復雜的信號通路。EMT細胞不僅具有形態(tài)特征，而且在蛋白表達上也有變化，如細胞黏附分子E-cadherin和N-cadherin表達降低，Ⅲ型中間絲蛋白vimentin等表達增加，導致細胞間的黏附力降低，從而促進腫瘤組織發(fā)生EMT，腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力[4]。惡性胸腔積液中非小細胞肺癌細胞也具備EMT表型，進一步從細胞學角度證實EMT現(xiàn)象存在于非小細胞肺癌[5]。本組實驗數(shù)據(jù)顯示，EMT在肺腺癌中的發(fā)生率為45.6%，而且在TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)、有淋巴結轉移及遠處轉移組的發(fā)生率分別為59%、62.9%和60.6%，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移及無遠處轉移組(32.6%、34.5%和36.8%)，提示EMT是促進肺腺癌侵襲及轉移的作用因素之一。

腫瘤細胞的EMT表型不是固定不變的，非小細胞肺癌經(jīng)過烷化類化療藥物治療后可誘導EMT發(fā)生，從而導致EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥。有研究表明，非小細胞肺癌細胞系上皮表型恢復后，原本耐藥的細胞重獲EGFR-TKIs的敏感性[6-8]。越來越多的研究結果證實EMT是EGFR-TKIs獲得性耐藥機制之一。大量研究表明，導致EMT的因素較多，包括腫瘤微環(huán)境、信號通路激活及表觀遺傳調控等[9-15]。目前，其已成為肺癌靶向治療耐藥研究領域中的熱點。

HMGB1是調節(jié)基因轉錄和基因修復的非組蛋白，是高遷移率組蛋白的主要成員之一，在細胞核、細胞質和細胞外環(huán)境中有許多生物學功能，并在多種疾病中發(fā)揮重要作用，特別是炎癥性疾病和癌癥。本組前期研究發(fā)現(xiàn)，在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者的外周血中HMGB1的表達水平顯著升高，但是HMGB1在肺腺癌中的表達及臨床意義的相關研究較少。國內外研究顯示，HMGB1在乳腺癌、子宮內膜癌和膀胱尿路上皮癌等惡性腫瘤中過表達[16-18]，且對預后有不良影響。HMGB1表達上調可促進細胞增殖，表達下調可促進細胞凋亡，影響細胞遷移[19-21]。本組結果顯示，HMGB1在肺腺癌中過表達，在正常肺組織中較少表達，且在高臨床分期、有淋巴結轉移及遠處轉移的肺腺癌患者中呈HMGB1高表達率，提示HMGB1表達與肺腺癌的轉移和侵襲有密切的關系。

腫瘤組織上皮表型蛋白丟失、轉錄因子表達和信號傳導通路活化開啟等均可引起EMT發(fā)生。國內外研究顯示，HMGB1在促進鼻咽癌、肝癌、卵巢癌等多種腫瘤發(fā)生EMT中發(fā)揮重要作用。TGF-β誘導咽癌FaDu細胞發(fā)生EMT時，HMGB1在此過程中維持細胞間質表型，而HMGB1沉默表達可顯著抑制上述細胞的侵襲和轉移能力[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1基因敲除可明顯抑制Huh7和MHCC97H肝癌細胞EMT，遷移和侵襲能力顯著降低。王真等[24]通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，HMGB1可能通過激活Snail/NF-κB信號通路誘導卵巢癌Skov3細胞的EMT。目前，國內尚未見HMGB1對肺腺癌實體腫瘤組織中發(fā)生EMT作用的研究，本實驗應用免疫組化法檢測肺腺癌組織中EMT表型蛋白及HMGB1蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)HMGB1表達與EMT呈正相關，提示HMGB1過表達可能會誘導肺腺癌由上皮表型向間質表型轉化。

綜上所述，HMGB1在肺腺癌組織中過表達，與EMT相關，進而增強腫瘤侵襲和轉移能力。HMGB1過表達在肺腺癌進展中具有重要作用，可能是重要的預后因素，為肺癌的臨床研究和治療提供新的理論依據(jù)。HMGB1高表達是否能促進肺腺癌EMT的發(fā)生，仍需進一步實驗加以驗證。