復發(fā)性流產(chǎn)患者微小RNA155與子宮內(nèi)膜HIF-1α VEGF 微血管密度的關(guān)系

蘇 倩 凌 琳 虞紅珍 宋恩學

復發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)發(fā)生2次及以上的自然流產(chǎn)，由于其病因、發(fā)生機制較為復雜，目前臨床缺乏有效的治療方法[1]。有關(guān)研究[2]發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細胞的增殖、絨毛血管新生在正常妊娠過程中發(fā)揮巨大作用。微小RNA(miR)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的短小RNA，具有高度保守性，能參與細胞增殖及凋亡、免疫反應、腫瘤發(fā)生、器官發(fā)育等相關(guān)生理、病理過程。miR-155是重要的miR類型,溫海燕等[3]研究發(fā)現(xiàn)，復發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織miR-155表達明顯失調(diào)，易受低氧因素誘導，于新生血管調(diào)控中起關(guān)鍵作用。因此，本研究分析復發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織miR-155表達情況，并分析其與子宮內(nèi)膜氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及微血管密度(microvessel density, MVD)的關(guān)系，探究滋養(yǎng)細胞的增殖、絨毛血管新生與miR-155表達水平異常是否有關(guān)，為進一步研究復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2020年5月在安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院接受治療的圍植入期復發(fā)性流產(chǎn)患者80例納入觀察組，患者年齡23～39歲，平均(31.4±2.3)歲；胎齡53～66 d。觀察組患者均符合《復發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識》[4]中復發(fā)性流產(chǎn)的診斷標準；患者均無生殖道感染、染色體異常、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、生殖道結(jié)構(gòu)異常、免疫系統(tǒng)疾病等情況。另同期選取80例正常早孕并要求終止妊娠婦女為對照組，患者年齡22～37歲，平均(31.2±2.5)歲；胎齡48～62 d。對照組所有對象經(jīng)臨床檢查顯示為正常宮內(nèi)早孕，且宮內(nèi)胚胎發(fā)育正常；無生殖道感染、染色體異常、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、解剖結(jié)構(gòu)異常、免疫系統(tǒng)疾病及先兆流產(chǎn)等情況。兩組對象的年齡、孕周、產(chǎn)次、胎數(shù)等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組對象基本資料比較

1.2 方法 兩組對象均經(jīng)清宮術(shù)獲取絨毛標本，Imag J分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，檢測miR-155、HIF-1α、VEGF、MVD水平，通過Person相關(guān)分析miR-155表達與HIF-1α、VEGF及MVD的關(guān)系。

1.2.1 miR-155水平測定 采用RT-qPCR技術(shù)檢測miR-155水平。TRlzol試劑盒購自美國Invirtogen公司，miR-155提取按照說明書進行，應用1%瓊脂糖變性凝膠對RNA完整性進行電泳檢測。操作步驟：將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補的DNA，即cDNA；選擇RT的反應體系：1 μg的RNA在70℃環(huán)境下進行10 min預變性，4 μL的5×RT Buffer，1 μL的酶復合物，miR-155、內(nèi)參照物U6逆轉(zhuǎn)錄引物混合1μmol，并將DEPC水加到20 μL，將未包含RT酶作為對照。設置RT反應條件是：16℃(30 min)、42℃(30 min)、94℃(15 min)；選擇含對照物的RT產(chǎn)物1 μL作為模板，開展普通PCR，對特異性進行分析。選擇反應體系：25 μL的1×Buffer，三磷酸脫氧核苷0.1 mmol，上游引物0.4 μmol，1 μL的下游引物0.25 μL的改造后相關(guān)耐熱DNA聚合酶，將雙蒸水加到25 μL。設置PCR的擴增條件是：2 min的94℃變性后，15 s的94℃，20 s的57℃，15 s的72℃，共開展35個循環(huán)。獲取的PCR產(chǎn)物進行4%瓊脂糖凝膠的電泳分析。選擇總RNA(1μg)，經(jīng)酶復合物的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成后，將U6視作內(nèi)參照，開展RT-qPCR檢測。設置反應條件是：92℃(2 min)、94℃(15 s)、60℃(1 min)，共開展40個循環(huán)。對標準后的miR-155具體相對表達量進行準確計算，采用2-△Ct進行表示，△Ct為CtmiR-155、CtU6差值，其中Ct值是反應實時的熒光強度明顯高于背景值時相關(guān)循環(huán)閾值。

1.2.2 HIF-1α、VEGF水平測定 采用免疫組化二步法[5]測定兩組絨毛組織內(nèi)HIF-1α、VEGF水平。將鼠抗人HIF-1α抗體及VEGF抗體、內(nèi)皮細胞CD34的單克隆抗體(1∶150)視作一抗，選擇免疫組化二步法進行染色，將磷酸鹽緩沖液視作一抗陰性對照；對絨毛組織內(nèi)HIF-1α、VEGF分布、含量進行觀察，并用CD34對MVD進行標記。

1.2.3 MVD檢測標準 以免疫組化的陽性反應程度表示表達量，陽性單位以PU表示，PU=[Ga-Gb]/Gmax100，其中Ga、Gb表示待測的結(jié)果、背景灰度值，而Gmax為256，是檢測最大的灰度值；在每張切片上計數(shù)5個視野，將平均值視為此片MVD。

1.2.4 MVD判定標準 觀察鏡下視野顯示棕黃色血管內(nèi)皮細胞、細胞簇，且管腔是>8個紅細胞構(gòu)成，排除帶有肌層血管[6]。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象絨毛組織內(nèi)miR-155、HIF-1α、VEGF及MVD比較 觀察組絨毛組織內(nèi)miR-155、HIF-1α、VEGF表達及MVD分布均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。兩組對象絨毛組織內(nèi)HIF-1α、VEGF免疫組化染色(CD34)情況：對照組正常細胞可見棕色或棕褐色，觀察組出現(xiàn)淺染色或不染色情況(圖1)。觀察組鏡下MVD分布量顯著少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

表2 兩組對象絨毛組織內(nèi)miR-155、HIF-1α、VEGF及MVD水平比較

注：A是對照組的絨毛組織內(nèi)HIF-1α表達；B是觀察組的絨毛組織內(nèi)HIF-1α表達情況(不染色或淺染色)；C是對照組的絨毛組織內(nèi)VEGF表達情況；D為觀察組的絨毛組織內(nèi)VEGF表達情況(不染色或淺染色)。

對照組

2.2 患者 miR-155表達量與HIF-1α、VEGF及MVD的關(guān)系 Person相關(guān)分析顯示，患者絨毛組織內(nèi)miR-155表達與HIF-1α、VEGF及MVD的相關(guān)系數(shù)r為0.544、0.574、0.642(P均<0.05)。見圖3～5。

圖3 患者miR-155表達量與HIF-1α相關(guān)性

圖4 患者miR-155表達量與VEGF相關(guān)性

圖5 患者miR-155表達量與MVD相關(guān)性

3 討論

復發(fā)性流產(chǎn)作為常見婦產(chǎn)科病癥，隨著患者的流產(chǎn)次數(shù)增加，其再次流產(chǎn)風險亦不斷升高；早期流產(chǎn)婦女中，復發(fā)性流產(chǎn)與染色體異常及生殖道生理異常因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素等多種因素有關(guān)，但部分病例仍難以明確病因，給針對性、有效性治療造成一定難度[7]。目前，臨床醫(yī)學針對復發(fā)性流產(chǎn)多采用注射免疫球蛋白及抗凝血等相關(guān)免疫治療為主，但少數(shù)患者治療效果欠佳。

HIF-1α活性易受氧濃度的調(diào)節(jié)[8]，其可將100多種的低氧適應性基因表達激活，主要涉及人體的血管形成及重塑、糖酵解、相關(guān)細胞增殖與凋亡、紅細胞生成等方面，在炎癥、腫瘤相關(guān)血管生成、加快腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移、保持細胞能量代謝等方面發(fā)揮重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的絨毛組織內(nèi)miR-155表達量顯著低于對照組，且miR-155表達與HIF-1α水平呈正相關(guān)(P<0.05)。從HIF-1α作為低氧應答相關(guān)全局性調(diào)控因子來看，HIF-1α于常氧條件下穩(wěn)定性較差，能通過泛素-蛋白酶解的通路被快速降解，但缺氧能對其降解進行抑制，增加HIF-1α表達，并能經(jīng)激活一系列的靶基因轉(zhuǎn)錄，促使細胞適應組織低氧、營養(yǎng)物質(zhì)供應降低情況，對細胞生存、增殖進行維持[10]；正常早孕婦女的絨毛滋養(yǎng)細胞在低氧情況下刺激相關(guān)細胞因子、生長因子，增加HIF-1α表達并激活，對胎盤的血管生成具有重要的促進作用。

本組資料還顯示，患者miR-155表達與VEGF、MVD水平呈正相關(guān)(P<0.05)，表明絨毛組織內(nèi)miR-155表達異?？赡芘c絨毛組織中新生血管存在密切聯(lián)系，此與王玲等[11]的研究結(jié)果較為一致。分析原因：VEGF是人體內(nèi)調(diào)節(jié)血管產(chǎn)生的重要中樞物質(zhì)，對血管內(nèi)皮細胞、滋養(yǎng)細胞相關(guān)分裂、遷移具有促進作用，能加快新生血管形成。楊樺等[12]在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，早孕情況下滋養(yǎng)細胞由于局部氧濃度減少，機體誘導HIF-1α高表達來上調(diào)VEGF相關(guān)因子表達，能促使絨毛組織耐受缺氧。在丁輝等[13]的研究中，滋養(yǎng)細胞釋放的VEGF能作用在血管內(nèi)皮細胞，與胎盤的血管新生、胎盤血管通透性具有密切聯(lián)系，血清中VEGF含量與子宮內(nèi)膜異位癥病理分期存在明顯相關(guān)性，可輔助支持本研究結(jié)果。此外，滋養(yǎng)細胞的表型轉(zhuǎn)換、胎盤相關(guān)血管發(fā)育障礙易引起血管機能不全，減少血管數(shù)目，進而造成MVD下降，且絨毛的螺旋動脈、滋養(yǎng)層相關(guān)侵襲表淺，導致胎盤的灌注減少，引起母兒循環(huán)障礙而出現(xiàn)自然流產(chǎn)[14-15]。由于本研究只對miR-155表達與HIF-1α、VEGF、MVD進行了相關(guān)性分析，未進一步探究miR-155對以上指標的影響途徑和作用機制，尚不能明確發(fā)現(xiàn)miR-155對復發(fā)性流產(chǎn)的具體影響程度，有待今后進一步研究。

綜上所述，圍植入期復發(fā)性流產(chǎn)婦女子宮內(nèi)膜的miR-155、HIF-1α、VEGF表達水平及MVD水平均低于正常早孕婦女，且絨毛組織miR-155與滋養(yǎng)細胞的增殖、新生血管異常具有密切聯(lián)系。miR-155在多種的病理及生理過程中均有一定參與作用，其表達過度對細胞增殖、MVD具有重要影響作用。