鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與外排泵機(jī)制及群體信號(hào)系統(tǒng)基因檢測(cè)分析

帥朝霞 鐘 峰 許 巖 吳 競(jìng)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)屬專性需氧的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然界并定植在人體體表及與外界相通的呼吸道、消化道等腔道內(nèi)，是造成院內(nèi)感染的重要機(jī)會(huì)性致病菌[1]。通常能夠引起患者呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、手術(shù)部位及侵入性操作后感染，特別是重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)的患者存在感染多重耐藥AB的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。根據(jù)全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2019年數(shù)據(jù)[4]顯示，AB對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率達(dá)到56%，部分地區(qū)更是達(dá)到78.6%，同時(shí)，多重耐藥率也在逐年上升。AB的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷修飾酶、16S rRNA甲基化酶，以及主動(dòng)外排泵機(jī)制等[5-6]。 隨著臨床多重耐藥(multidrug-resistance，MDR)、碳青霉烯類耐藥(carbapenem-resistance，CR)和泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)AB菌株，以及高致病性。高毒力的AB出現(xiàn)，所致的社區(qū)及院內(nèi)感染暴發(fā)流行給臨床治療帶來(lái)了極大的困難，研究抗菌藥物的治療方案已成為全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)關(guān)注的重大問(wèn)題。AB群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensingsystem，QS)主要包括信號(hào)分子合成酶(Aba I)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(Aba R)，目前已有研究[7]表明AB耐藥性與QS具有相關(guān)性。同時(shí)，外排泵系統(tǒng)基因高表達(dá)也是AB主要的耐藥機(jī)制之一。本研究通過(guò)分析CR-AB、MDR-AB和非多重耐藥AB中主動(dòng)外排泵基因ade B、ade J、abe S、abe M及QS相關(guān)基因Aba I、Aba R的分布，探討不同耐藥AB耐藥性與外排泵基因及QS系統(tǒng)的關(guān)系特點(diǎn)，為臨床制定用藥方案及院感防控提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 采集2018年1月至 2021年7月皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床分離的130 株AB菌(去除同一患者同標(biāo)本重復(fù)菌株)，其中痰液標(biāo)本93株、肺泡灌洗液標(biāo)本10 株、咽拭子標(biāo)本9株、尿液標(biāo)本9株、分泌物標(biāo)本7株、血培養(yǎng)標(biāo)本2株。臨床分離的AB菌株均經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀鑒定。藥敏質(zhì)控菌株：大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)，均來(lái)自安徽省耐藥監(jiān)測(cè)中心。

1.2 主要儀器試劑 VITEK2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀(法國(guó)Bio Mérieux)，凝膠成像儀、PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad)，生物安全柜HR40-IIA2(海爾生物醫(yī)療)，雙向電泳分析儀(北京六一儀器廠)，高壓滅菌鍋(上海博迅)，PCR 反應(yīng)試劑(寶生物工程)，電泳瓊脂糖(上海生工)，GN、AST-GN13(法國(guó)Bio Mérieux )。

1.3 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 臨床分離的130株菌株經(jīng) VITEK2-Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀進(jìn)行鑒定確認(rèn)為AB后，按菌株的耐藥性分為多重耐藥AB組31株(23.85%)、碳青霉烯類耐藥AB組43株(33.08%)、非多重耐藥AB組56株(43.07%)。其中多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDR-AB)指對(duì)3類及3類以上抗菌藥物耐藥的AB，碳青霉烯類耐藥AB(CR-AB)指對(duì)亞胺培南或美羅培南任一藥物耐藥的AB。

1.4 AB外排泵基因及QS系統(tǒng)相關(guān)基因檢測(cè) 采用煮沸法提取二次活化后細(xì)菌的DNA，接種環(huán)挑取菌落于600 μL緩沖液后震蕩混勻，100℃煮沸15 min，冷卻后離心10 min，將得到的上清液DNA濃度調(diào)整為50～100 ng/μL作為模板備用。PCR反應(yīng)體系：模板2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、Premix 10 μL去離子水6 μL，總反應(yīng)體積20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：Aba I 預(yù)變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。Aba R預(yù)變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。ade B 和ade J 預(yù)變性94℃ 5 min，95℃變性1 min，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。abe M 和abe S預(yù)變性94℃ 5 min，95℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。所用引物見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳恒壓120 V，電流70 mA，30 min。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察并記錄。將擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Gene Bank 比對(duì)。

表1 AB外排泵基因及QS系統(tǒng)相關(guān)基因引物序列及產(chǎn)物大小

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同耐藥性AB的構(gòu)成比及藥敏分析結(jié)果 130株AB中，非多重耐藥Ab(56株)對(duì)測(cè)試藥物耐藥率均低于15%，其中對(duì)氨基糖苷類、碳青霉烯類、四環(huán)素類及多肽類抗菌藥物均無(wú)耐藥性。多重耐藥AB(31株)對(duì)多數(shù)抗菌藥物均出現(xiàn)較高耐藥率，對(duì)頭孢他啶、復(fù)方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均大于85%，對(duì)替加環(huán)素耐藥率為14.29%，多粘菌素?zé)o耐藥性。碳青霉烯類耐藥AB(43株)對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率較高，均超過(guò)85%，對(duì)多粘菌素?zé)o耐藥性。見表2。

表2 3組不同耐藥AB菌株藥敏分析

2.2 AB外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)基因分布 PCR檢測(cè)130株不同耐藥AB外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)基因，其中ade B檢出率為43.85%(57株)，ade J檢出率為48.46% (63株)， abe M檢出率為48.46%(63株)，abe S 檢出率為46.15%(60株) ，Aba I 檢出率為46.15%(60株)，Aba R 檢出率為48.46%(63株)。見表3。在非多重耐藥菌株中，攜帶外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)基因率均低于多重耐藥菌株及碳青霉烯類耐藥菌株。群體信號(hào)系統(tǒng)基因Aba I、Aba R在多重耐藥菌株中檢出率較碳青霉烯類耐藥菌株明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.049、6.188，P均<0.05)。 PCR 擴(kuò)增的經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳圖見圖 1。

注：M為DNAMarker；N為陰性對(duì)照；1～4為DNA擴(kuò)增陽(yáng)性菌株。

表3 3組外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)基因分布[株(%)]

2.3 攜帶外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)基因AB的耐藥性分析 PCR檢測(cè)130株攜帶不同外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)基因的AB耐藥性均有差異，其中含有外排泵基因ade B、ade J、abe M、abe S的AB耐藥性明顯高于不含上述基因的AB，其中以頭孢菌素類耐藥率的差異最為明顯(P均<0.05)。攜帶有Aba I、Aba R基因的AB對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率較不含有該基因AB的耐藥率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見表4。

表4 攜帶外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)基因AB的耐藥性分析

3 討論

AB是一種需氧的革蘭陰性條件致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中，由于具有較強(qiáng)的存活力和抵抗力，臨床感染已經(jīng)成為全球醫(yī)院需要解決的難題。根據(jù)全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2014～2019年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告[8]，2019年AB對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率為55.5%、57.1% ，且多重耐藥和泛耐藥的菌株分離率持續(xù)增加，同時(shí) SENTRY 耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，歐洲地區(qū) 1997至2016 年AB對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為 60.6%和 64.4%，AB的耐藥形勢(shì)日趨嚴(yán)重[9]，已給臨床的治療帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。多粘菌素和替加環(huán)素是治療多重耐藥乃至泛耐藥的AB的“最后防線”，但是目前多粘菌素和替加環(huán)素耐藥的AB在臨床上的分離率正逐漸升高。

目前，在AB中報(bào)道的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)有Ade ABC、Ade IJK、Ade FGH、Ade DE、Ade XYZ、Abe M、Abe S 等，外排泵可將已在細(xì)菌體內(nèi)的藥物泵出至細(xì)菌體外，導(dǎo)致胞內(nèi)抗生素藥物濃度降低，從而導(dǎo)致藥物殺菌作用減弱[10-12]。同時(shí)，細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)是一種細(xì)菌之間的通信過(guò)程，使細(xì)菌能夠共同改變行為，以響應(yīng)周圍微生物群落的細(xì)胞密度和物種組成的變化，AB群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由 Aba I(信號(hào)分子合成酶)和 Aba R(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)構(gòu)成，當(dāng)前已有研究[13-16]表明，AB群體感應(yīng)與其運(yùn)動(dòng)性、抗生素抗性、生存特性和生物膜形成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥菌株及碳青霉烯類耐藥菌株攜帶外排泵基因ade B、ade J、 abe M 、abe S 和群體信號(hào)系統(tǒng)基因Aba I、Aba R明顯高于非多重耐藥組，檢測(cè)出帶有Aba I、Aba R基因的AB對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率較不含有該基因的耐藥率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示外排泵基因ade B、ade J、abe M、abe S及群體信號(hào)系統(tǒng)基因Aba I、Aba R與細(xì)菌耐藥性具有相關(guān)性。

綜上所述，本院耐藥的AB主要集中在攜帶外排泵基因及群體信號(hào)系統(tǒng)基因的菌株中，其中，耐碳青霉烯類菌株的群體信號(hào)系統(tǒng)在其耐藥性中起到重要的作用，應(yīng)引起院感防控和臨床治療方面的足夠重視。