羊口瘡病毒ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞周期、凋亡及免疫細胞因子的影響

王憲軍，向 華，張旭梅，任玉鵬，朱江江

(1.西南民族大學 畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用 四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

羊口瘡是由口瘡病毒(Orfvirus，ORFV)引起的以病羊口唇、鼻等部位形成水泡、膿皰或痂皮等特征的人獸共患傳染病，主要侵害山羊、綿羊等小反芻獸[1-2]。羊口瘡的流行不僅影響畜牧業(yè)的發(fā)展，也嚴重威脅著人類的健康[3]。當前主要通過接種疫苗的方式來控制ORFV的感染。然而，目前尚無商品化的疫苗來預(yù)防該疾病的發(fā)生。羊口瘡反復(fù)暴發(fā)的現(xiàn)狀已成為制約養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸和重要的公共衛(wèi)生問題。假如能夠通過對ORFV誘導機體免疫反應(yīng)的分子機制研究從而推動羊口瘡靶向藥物的研發(fā)，將從根本上解決目前羊口瘡治標不治本的現(xiàn)狀。因此，ORFV誘導機體免疫反應(yīng)的分子機制研究成為急需解決的關(guān)鍵科學問題，對于推動養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和保障人類人身安全具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬，是一種雙鏈DNA病毒[4-5]。ORFV基因組全長138 kb，G+C含量高達63%～64%[6]。ORFV基因組在其末端都有一個反向重復(fù)序列，且末端基因是可變區(qū)，常常與毒力、免疫調(diào)節(jié)和發(fā)病機制等有關(guān)[7]。細胞因子是由免疫細胞(比如T細胞、B細胞、巨噬細胞等)和某些非免疫細胞(如內(nèi)皮細胞、表皮細胞等)經(jīng)刺激而合成和分泌的一類高活性的小分子蛋白質(zhì)。ORFV的感染過程中，宿主細胞可釋放大量的細胞因子(如 IL-6、IL-8、TNF-α 等)參與免疫炎癥反應(yīng)，ORFV自身也能夠產(chǎn)生抗炎蛋白來逃避宿主免疫反應(yīng)。如黃忍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，作為ORFV編碼的末端129蛋白可抑制山羊睪丸細胞內(nèi)免疫效應(yīng)分子IL-1β、IL-6和IFN-γ的表達。ORFV 121蛋白可通過與細胞質(zhì)NF-κB-p65 相互作用，抑制p65 Ser536磷酸化和核轉(zhuǎn)運，從而阻止免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[9]。由此可見，宿主的免疫系統(tǒng)在機體抗ORFV過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。同時，朱曉琴等[11]、羅杰等[12]發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1β和IL-8可促進體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和大鼠動脈平滑肌細胞的增殖。INF-γ可明顯地抑制人骨肉瘤細胞株增殖現(xiàn)象[13]。由此可見，細胞因子的分泌在反應(yīng)宿主細胞對抗病毒的免疫應(yīng)答效應(yīng)的同時，推測其對細胞周期也產(chǎn)生一定的影響。然而細胞周期和細胞凋亡密切相關(guān)，細胞增殖現(xiàn)象的表現(xiàn)也一定程度上反映細胞凋亡的水平[14]。ORFV118是羊口瘡病毒基因組末端變異區(qū)的一片段，目前對其研究主要為ORFV118作為一種免疫原性蛋白，可以通過刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答，進而局部產(chǎn)生強烈的炎癥反應(yīng)[15]，而對其細胞周期、凋亡及誘導機體發(fā)生免疫應(yīng)答的機制目前仍不清楚。

本研究旨在克隆羊口瘡病毒ORFV118基因并對其進行生物信息學分析；隨后將構(gòu)建的表達載體pEGFP-ORFV118轉(zhuǎn)染山羊睪丸支持細胞，利用實時熒光定量檢測技術(shù)分析ORFV118蛋白對機體免疫應(yīng)答相關(guān)的4種細胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ及TNF-α)表達水平的影響，同時檢測ORFV118蛋白對細胞周期及凋亡的作用，研究結(jié)果可為進一步研究ORFV118在誘導機體免疫應(yīng)答及全面揭示該蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株、細胞和載體

羊口瘡病毒JYY-ORFV株為由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室分離、鑒定保存；pEGFP-NI載體和山羊睪丸支持細胞由本實驗室保存；DH5α為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑及儀器

PremixTaq、T4DNA連接酶、DL2000 DNA Marker、SYBR?Premix ExTaqTM(2×)均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、pMD19-T載體購自O(shè)MEGA公司；Hind Ⅲ、BamH Ⅰ為上海玉博生物公司產(chǎn)品； DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品；青霉素-鏈霉素購自Hyclone公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TRIzol、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒、QuantStudio3購自美國Thermo Fisher Scientific公司；細胞周期及凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；山羊IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自睿信生物公司；流式細胞儀購自日本SYSMEX公司；熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；氯仿、異丙醇、DEPC等其他試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.3 ORFV118基因的克隆鑒定及真核重組表達載體的構(gòu)建

參照GenBank登錄的ORFV SY17株的基因組序列(登錄號：MG 712417.1)，Primier Primer 5軟件設(shè)計1對特異性引物為P1：5′-CGGGATCCATGTCATTTCAACGGGGCA-3′；P2：5′-CCAAGCTTTTAGCGGGAGTAGCCGTC-3′。以提取的羊口瘡病毒的DNA為模板，擴增ORFV118基因。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為200 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L Pre mixTaq 12.5 μL，10 μmol/LP1和P2引物各1 μL，ddH2O補足。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 25 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測條帶正確后進行膠回收，并將其連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌落PCR和測序鑒定后質(zhì)粒命名為pMD19-ORFV118。

構(gòu)建真核表達載體pEGFP-ORFV118選擇Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶，亞克隆引物如下，上游引物5′-AAGCTTATGTCATTTCAACGGGGCAA-3′(劃線部分為HindⅢ酶切位點)；下游引物5′-GGATCCTTAGCAGGAGTAGCCGTCAC-3′(劃線部分為BamHⅠ酶切位點)。以質(zhì)粒pMD19-ORFV118為模板，亞克隆引物擴增，將擴增的片段連接到載體pEGFP-N1并轉(zhuǎn)化，雙酶切及測序正確后保存，構(gòu)建真核表達載體pEGFP-ORFV118。

1.4 ORFV118基因的生物信息學分析

使用ProtParam在線軟件分析ORFV118基因的理化性質(zhì)；SignalP 4.1分析信號肽；Protscale分析疏水性；TMHMM Server v.2.0分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；SOPMA和SWISS-MODEL分別進行二、三級結(jié)構(gòu)分析；采用NetNGlyc 1.0和NetPhos 3.1分別預(yù)測ORFV118蛋白N糖基化位點和磷酸化位點；在線軟件WOLF進行蛋白亞細胞定位預(yù)測。

1.5 山羊睪丸原代細胞的復(fù)蘇及pEGFP-ORFV118重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

將本實驗室保存的第6代山羊睪丸細胞復(fù)蘇至6孔板[16]，細胞匯合度達70%～90%，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pEGFP-ORFV118轉(zhuǎn)染至細胞，并以空載體pEGFP-N1為陰性對照，以正常生長的細胞為空白對照。轉(zhuǎn)染48 h后，提取細胞總RNA，檢測轉(zhuǎn)錄動力學，具體步驟參考文獻[8]。

1.6 檢測ORFV118蛋白在山羊睪丸原代細胞中的蛋白表達

按照1.5步驟操作，轉(zhuǎn)染48 h后，按照蛋白提取試劑盒說明書收集細胞總蛋白，以鼠抗GFP抗體(1∶500)為一抗，HRP-兔抗鼠IgG(1∶10 000)為二抗，通過Western Blot檢測ORFV118蛋白的蛋白表達水平。試驗共設(shè)置2組，分別為pEGFP-ORFV118轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組，且每組3個重復(fù)。

1.7 ORFV118蛋白對睪丸支持細胞4種細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)表達水平的影響

參照1.5的步驟，轉(zhuǎn)染前0 h和轉(zhuǎn)染后48 h，分別收集細胞RNA樣和細胞上清液，用RT-qPCR和ELISA檢測細胞內(nèi)外的IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α表達情況，RT-qPCR引物見表1。反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR?Premix ExTaqTM10 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，100 ng/μL的模板1 μL，ROX 0.2 μL，ddH2O補足。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，同步采集熒光信號，72 ℃ 30 s，一共35個循環(huán)，熔解曲線：95 ℃變性15 s，60 ℃冷卻1 min，使DNA雙鏈充分結(jié)合，最后從60 ℃逐步加熱至95 ℃，每一步增加0.15 ℃并保持1 s，同時采集熒光信號。以GAPDH為參比基因，每個待測樣本設(shè)置3個重復(fù)。細胞上清液參考ELISA試劑盒說明書檢測ORFV118對睪丸支持細胞上清中IL-1β和IFN-γ的分泌情況。

表1 細胞因子的引物序列表1 Primer sequences of cytokine

1.8 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞周期及周期相關(guān)基因的影響

參照1.5的步驟，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，PBS洗滌2次，95%乙醇固定過夜，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，向細胞中加入400 μL碘化丙啶染色液，吹打混勻，37 ℃避光30 min，用流式細胞儀進行檢測。根據(jù)GenBank公布的山羊周期相關(guān)基因CDK2和牛的P21序列，設(shè)計引物，引物序列見表2。RT-qPCR檢測周期相關(guān)基因的mRNA表達水平(UXT為內(nèi)參基因)。RT-qPCR反應(yīng)體系和條件同1.7。

1.9 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的影響

參照1.5的步驟，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，PBS洗滌2次，使用Binding Buffer緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V/FITC，室溫避光5 min，再加入10 μL碘化丙錠溶液(PI)，并加400 μL PBS，立刻進行流式檢測。根據(jù)GenBank 公布的山羊凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7序列以及牛凋亡相關(guān)基因p53、BCL2L11序列設(shè)計引物，引物序列見表2。RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)基因的mRNA表達水平(UXT為內(nèi)參基因)。RT-qPCR反應(yīng)體系和條件同1.7。

表2 細胞周期及凋亡相關(guān)基因的引物序列Tab.2 Primers sequences of cell cycle and apoptosis-related genes

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用2-ΔΔCT方法分析ORFV118蛋白對4種細胞因子mRNA水平的影響，其中ΔCt=Ct細胞因子-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt細胞因子48 h-ΔCt細胞因子0 h。計算結(jié)果在SPSS 22.0中進行單因素方差分析和顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。分析ORFV118蛋白對周期或凋亡相關(guān)基因的mRNA水平時，采用2-ΔΔCT方法進行分析，其中ΔCt=Ct周期或凋亡相關(guān)基因-CtUXT。并將計算結(jié)果在SPSS 22.0中進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORFV118基因的PCR擴增、克隆鑒定

成功擴增ORFV118基因，瓊脂糖凝膠電泳可檢測與預(yù)期大小相符的片段(圖1-A)?？寺∞D(zhuǎn)化后，菌落PCR檢測顯示，與預(yù)期的ORFV118基因的大小相符(圖1-B)。

A.ORFV118基因PCR擴增； B.質(zhì)粒pMD19T-ORFV118的PCR擴增。M.2 000 bp DNA ladder；P.陽性對照；N.陰性對照；1.ORFV118基因。圖4同。

2.2 ORFV118基因的生物信息學分析

生物信息學分析結(jié)果顯示，ORFV118基因309 bp，共編碼102個氨基酸。分子質(zhì)量為11.58 ku；蛋白呈親水性(圖2-A)，無信號肽(圖2-B)，為不穩(wěn)定的非分泌性蛋白；同時，無保守結(jié)構(gòu)域(圖 2-C)和跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2-D)；二級結(jié)構(gòu)顯示(圖2-E)，α螺旋占17.65%，β螺旋占2.94%，無規(guī)卷曲為68.63%，延伸鏈為10.78%。三級結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖2-F。在第7，87位氨基酸處有2個N糖基化位點(圖2-G)；ORFV118蛋白有11個絲氨酸、2個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點(圖2-H)。亞細胞定位顯示，該蛋白主要定位于細胞核(圖2-I)。

A.ORFV118蛋白的疏水性分析；B.ORFV118蛋白的信號肽預(yù)測；C.ORFV118蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；D.ORFV118蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；E.ORFV118蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；F.ORFV118蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；G.ORFV118蛋白的糖基化位點預(yù)測；H.ORFV118蛋白的磷酸化位點預(yù)測；I.ORFV118蛋白的亞細胞定位分析。

2.3 ORFV118基因真核重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

真核表達載體pEGFP-ORFV118經(jīng)Hind Ⅲ、BamH Ⅰ雙酶切后電泳鑒定獲得的目的基因與預(yù)期條帶大小相符(圖3)，表明構(gòu)建的質(zhì)粒正確。

M.5000 DNA Ladder；1.pEGFP-ORFV118的Hind Ⅲ、BamHⅠ雙酶切鑒定。M.5000 DNA Ladder；1.pEGFP-ORFV118 digested by Hind Ⅲ and BamHⅠ.

2.4 pEGFP-ORFV118重組質(zhì)粒在睪丸支持細胞的mRNA表達水平分析

轉(zhuǎn)染48 h后，提取細胞總RNA，通過RT-PCR也能擴增到與預(yù)期ORFV118基因大小相似的目的條帶，表明ORFV118基因在細胞中發(fā)生了轉(zhuǎn)錄(圖4)。

圖4 RT-PCR檢測pEGFP-ORFV118重組質(zhì)粒的mRNA表達分析Fig.4 mRNA analysis of pEGFP-ORFV118

2.5 ORFV118蛋白在山羊睪丸支持細胞中的表達分析

Western Blot 結(jié)果顯示(圖5)，轉(zhuǎn)染空載pEGFP-N1的山羊睪丸支持細胞內(nèi)僅可見GFP蛋白(25 ku

圖5 ORFV118蛋白表達的Western Blot鑒定Fig.5 Western Blot identification of ORFV118 protein

2.6 4種細胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)的表達水平分析

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，與空載體pEGFP-N1相比，在轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV118的細胞中，IL-1β和IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均受到了不同程度的抑制，而IL-6和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白水平受到一定程度的促進(圖6)。

不同小寫字母表示處理較對照在0.05水平上差異顯著；不同大寫字母表示處理較對照組在0.01水平上差異極顯著。圖7—8同。Different lowercase letters indicate significant difference at the level of 0.05 between the treatment and the control；Different capital letters indicate extremely significant difference at the level of 0.01 between the treatment and the control.The same as Fig.7—8.

2.7 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞周期及周期相關(guān)基因的影響

細胞周期結(jié)果顯示(圖7-A、B)，與空載體pEGFP-N1相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV118組S期細胞數(shù)減少(P<0.05)；與空載體pEGFP-N1相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV118組G2/M期細胞數(shù)增加(P<0.01)，可見ORFV118蛋白對細胞的DNA合成期(S期)有阻滯作用，對DNA合成后期(G2/M期)具有促進作用。周期相關(guān)基因檢測結(jié)果顯示，與空載體pEGFP-N1相比，ORFV118蛋白可上調(diào)基因CDK2的mRNA表達水平(P<0.01)，P21無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖7-C、D)。

2.8 ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的影響

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1組的細胞早期凋亡率是25.39%，晚期凋亡率為27.02%；pEGFP-ORFV118轉(zhuǎn)染組細胞的早期凋亡率是23.56%，晚期凋亡率為18.68%?？梢?，ORFV118蛋白抑制了細胞的凋亡作用(圖8-A、B)。凋亡基因結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，ORFV118蛋白可極顯著下調(diào)促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA水平(P<0.01)。Bcl-2、BaX、BCL2L11、P53、PARP1無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖8-C)。

A.pEGFP-N1對山羊睪丸支持細胞凋亡的影響； B.pEGFP-ORFV118對山羊睪丸支持細胞凋亡的影響；C.RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)基因的影響。A.Effect of pEGFP-N1 on apoptosis of goat testicular sertoli cells；B.Effect of pEGFP-ORFV118 on apoptosis of goat testicular sertoli cells C.Effect of RT-qPCR detect apoptosis-related genes.

3 結(jié)論與討論

羊口瘡病毒自1923年被發(fā)現(xiàn)后，直到1957年被首次分離獲得[17]。隨著養(yǎng)羊業(yè)的擴大，飼養(yǎng)管理的不善，導致羊口瘡病毒迅速在世界范圍內(nèi)擴展開來。由于感染口瘡的羊群導致其采食量下降，易引起其他疾病繼發(fā)感染、機體消瘦、生長緩慢等現(xiàn)象，該病的發(fā)生對整個養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[18-19]。目前，對于羊口瘡病毒的治療主要還是集中于對癥治療，尚無商品化的疫苗，因此，探究羊口瘡病毒致病機理對養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展是十分必要的。本研究在過表達ORFV118基因的基礎(chǔ)上，探究了ORFV118蛋白調(diào)控新生山羊睪丸原代細胞免疫應(yīng)答相關(guān)的4種細胞因子(IL-6、IFN-γ、IL-1β及TNF-α)的mRNA表達水平的影響，為進一步探討ORFV118在誘導機體免疫應(yīng)答中的作用，以及對羊口瘡病毒疫苗以及新藥物的研發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。

生物信息學的分析可在一定程度指導基因存在的潛在生物學功能[20]。本研究成功克隆羊口瘡病毒ORFV118基因的全長，長度為309 bp。對其生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白共編碼102個氨基酸，分子質(zhì)量約為11.58 ku，為不穩(wěn)定蛋白；結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測顯示，該蛋白無信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)域，為非分泌性蛋白；Khoury等[21]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)翻譯后存在磷酸化、糖基化和乙?；确绞?。本研究對ORFV118蛋白修飾結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)118蛋白在第7和87位氨基酸處有2個N糖基化位點；ORFV118蛋白有11個絲氨酸、2個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點，推測這些位點可能是調(diào)控ORFV118蛋白功能的一些關(guān)鍵位點。同時，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，該蛋白以無規(guī)卷曲為主，提示該蛋白結(jié)構(gòu)松散、不穩(wěn)定。

支持細胞、間質(zhì)細胞和生精細胞是山羊睪丸的3種細胞類型[22]。其中支持細胞可參與阻止外來抗原進入曲細精管，防止抗原和抗體之間產(chǎn)生的免疫應(yīng)答[23]，且支持細胞分泌物可通過抑制淋巴細胞增殖，從而減少器官移植中的免疫排斥反應(yīng)。細胞因子可通過睪丸細胞自分泌、旁分泌或者內(nèi)分泌等形式產(chǎn)生，并通過局部調(diào)節(jié)或信號通路途徑影響睪丸的功能[24]。同時，ORFV可感染山羊睪丸細胞，并引起肉眼可見的空斑，且會刺激宿主產(chǎn)生多種細胞因子，參與機體的免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等作用[25]。因此，細胞因子的準確定量對評價生物機體免疫狀態(tài)具有重要參考作用[26]。研究顯示，在病毒感染后，病毒誘導宿主細胞NF-κB等信號通路的活化，產(chǎn)生以IL-1α、IL-6和IL-8細胞因子為主的信號分子，調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答[27]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，ORFV118基因轉(zhuǎn)染山羊睪丸支持細胞后可導致IL-1β和IFN-γ的表達水平明顯低于陰性對照組，而IL-6、TNF-α的表達水平呈一定的上升趨勢，提示ORFV118蛋白可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-α的合成和分泌的能力，進而影響機體的免疫功能。

病毒感染與宿主是一個相互博弈的過程[28-29]，通過長期的進化過程，病毒為了能使其在宿主細胞內(nèi)生存，可通過各種策略來對抗宿主的防御機制[30-31]。細胞凋亡作為其中的一種，是宿主細胞應(yīng)對病毒感染的重要防御作用之一。例如痘病毒家族的痘苗病毒(Vacciniavirus，VACV)編碼的F1L蛋白[32]、黏液瘤病毒(Myxomavirus，MYXV)24，25[33]編碼的M11L蛋白和鼠痘病毒(Ectromeliavirus，ECTV)27[34]編碼EVM025蛋白已被證實對宿主細胞具有抗凋亡作用。且彭建偉[35]在研究中發(fā)現(xiàn)，ORFV125能抑制宿主細胞凋亡，隨著時間的延長，ORFV125蛋白對宿主細胞抑制作用更加明顯。ORFV118基因是羊口瘡病毒兩端相對不保守的基因之一，這些基因常常與宿主選擇、免疫逃逸、免疫調(diào)節(jié)及病毒毒力等有關(guān)。目前，ORFV118蛋白是否對宿主細胞的凋亡產(chǎn)生影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，ORFV118蛋白抑制山羊睪丸支持細胞凋亡現(xiàn)象，且下調(diào)促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表達水平，而對凋亡基因BaX、BCL2L11、P53、PARP1無影響。同時，本研究發(fā)現(xiàn)ORFV118蛋白對細胞的DNA合成期(S期)有阻滯作用，對DNA合成后期(G2/M期)具有促進作用，且下調(diào)基因CDK2的mRNA表達水平，而對周期基因P21的mRNA表達水平無影響。具體ORFV118蛋白誘導細胞凋亡的作用機制以及如何調(diào)控細胞周期仍需進一步確定。

ORFV118蛋白對山羊睪丸支持細胞的DNA合成期(S期)有阻滯作用，對DNA合成后期(G2/M期)具有促進作用，且下調(diào)基因CDK2的mRNA表達水平。ORFV118蛋白可抑制細胞凋亡，且下調(diào)促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表達水平；ORFV118蛋白對細胞因子IL-1β和IFN-γ起到了不同程度的抑制作用，而對IL-6和TNF-α呈促進作用。這些結(jié)果為進一步探討ORFV118蛋白在誘導機體免疫應(yīng)答及全面揭示該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。