綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽全蛋白雙向電泳體系的建立與優(yōu)化

高素紅，葛長(zhǎng)虹，周?chē)?guó)娜，姚淑娟，路常寬，高寶嘉

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北科技師范學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北 昌黎 066600；3.河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 昌黎 066600)

近年來(lái)，綠盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Dür)發(fā)生愈加猖獗，對(duì)釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。前期的研究表明，早春綠盲蝽對(duì)葡萄冬芽的危害是影響酒葡萄植株長(zhǎng)勢(shì)和全年產(chǎn)量、質(zhì)量的關(guān)鍵因素[1]。已有的研究證實(shí)，植食性昆蟲(chóng)通過(guò)唾液蛋白消化溶解植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行取食，而植物則利用自身某些結(jié)構(gòu)蛋白和昆蟲(chóng)唾液蛋白中的激發(fā)子進(jìn)行特異結(jié)合，產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性反應(yīng)，生成抗性蛋白和抗性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)昆蟲(chóng)的抵抗[2]。目前，綠盲蝽唾液蛋白與赤霞珠葡萄結(jié)合的受體蛋白仍不清楚。因此，通過(guò)獲得綠盲蝽取食誘導(dǎo)下赤霞珠葡萄冬芽的全蛋白，進(jìn)而鑒定出與綠盲蝽唾液蛋白特異性結(jié)合的蛋白受體，對(duì)于揭示赤霞珠葡萄對(duì)綠盲蝽取食產(chǎn)生防御反應(yīng)的分子機(jī)制具有重要意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究特定時(shí)間、空間以及環(huán)境因子等條件下，生物物種個(gè)體、器官、組織、細(xì)胞以及體液等的總蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的常用手段[3]，也是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。1975年，蛋白質(zhì)組學(xué)首先由O′Farrell[4]建立。Bjellqvist等[5]在1982年利用改進(jìn)的雙向電泳技術(shù)得出凝膠圖譜，看到明顯的蛋白點(diǎn)，再結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)蛋白點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。已經(jīng)建立的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)包括UniProt(SWISS-PROT、TrEMBL和PIR-PSD)、PDB、BioGRID、DDBJ、ExPasy、Gepasi、IntAct、KEGG、MINT、MS-Fit、NCBI、STRING等[6-7]，可快速鑒定已知蛋白質(zhì)種類(lèi)。雙向電泳技術(shù)仍是目前獲得動(dòng)植物全蛋白質(zhì)組，尋找差異蛋白，蛋白質(zhì)定性定量，篩選、鑒定蛋白受體以及揭示其蛋白水平變化機(jī)制的經(jīng)典研究手段[8-11]。目前，有關(guān)赤霞珠葡萄冬芽的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以綠盲蝽取食誘導(dǎo)下赤霞珠葡萄冬芽為試材，通過(guò)比較分析不同的蛋白提取方法、上樣量及考馬斯亮藍(lán)染色所得到的赤霞珠葡萄冬芽全蛋白雙向凝膠電泳圖譜效果，構(gòu)建適用于葡萄冬芽蛋白質(zhì)分析的最佳雙向電泳技術(shù)體系，以便為后續(xù)揭示在綠盲蝽取食誘導(dǎo)和機(jī)械損傷下，赤霞珠葡萄蛋白質(zhì)組的差異變化，篩選差異蛋白，分析其功能和結(jié)構(gòu)以及為綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠葡萄抗性反應(yīng)和抗性機(jī)制的進(jìn)一步研究提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 綠盲蝽由河北省植物保護(hù)研究所(保定)提供，在27 ℃、L∶D = 16 h∶8 h、強(qiáng)度66%、濕度60%條件下，用新鮮四季豆飼養(yǎng)綠盲蝽試驗(yàn)種群。挑選大小一致的3齡若蟲(chóng)[12-13]，試驗(yàn)前4～6 h饑餓處理，進(jìn)行接蟲(chóng)試驗(yàn)。

1.1.2 樣品采集 在河北省昌黎縣朗格斯酒莊有限公司釀酒葡萄種植基地進(jìn)行試驗(yàn)。供試釀酒葡萄品種為赤霞珠，生長(zhǎng)狀況良好。選擇同一葡萄植株上距地面50～100 cm外觀和長(zhǎng)勢(shì)一致的2個(gè)飽滿(mǎn)冬芽作為樣本，分別編號(hào)記作接蟲(chóng)芽和對(duì)照芽。其中，接蟲(chóng)芽：于冬芽上接入5頭健壯的綠盲蝽3齡若蟲(chóng)后套袋；對(duì)照芽不進(jìn)行任何處理直接套袋。每處理3次重復(fù)。24 h后分別摘取葡萄冬芽樣品置于液氮暫存，然后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室放置于-80 ℃冰箱凍存。

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 生化藥劑 TCA、Acetone、2-Hydroxy-1-ethanethiol、PVPP、Sucrose、SDS、Tris-base、HCl、Ammonium acetate、Methyl alcohol、Urea、Thiourea、CHAPS、DTT、Ampholyte solution、Ampholime、Bromophenol blue、Coomassie brilliant blue、GLYCEROL、Iodoacetamide、Acrylamide、Ammonium persulphate、TEMED、Glycine、Low melting point agarose、平衡酚、雙甲叉丙烯酰胺，以上藥品購(gòu)自Sigma公司，均為分析純。mineral oil、IPG干膠條pH值 3～10 24 cm、pH值4～7 17 cm購(gòu)自 GE Healthcare公司。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司。

蛋白提取液、蛋白裂解液、平衡液A、平衡液B、SDS-PAGE凝膠溶液、0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液、固定液、染色液、脫色液的配制方法參考王銀翠等[14]的方法進(jìn)行。

1.1.3.2 主要儀器 GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、掃描儀(ImageScannerⅢ)、723可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)、冷凍干燥機(jī)(LABCONCO)、FA2204B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)、雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(GE)、電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)、XH-C渦旋混合器(榮華儀器制造有限公司)、搖床、移液器(Eppendorf)、石英比色皿等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備與濃度測(cè)定 TCA-丙酮法參考王銀翠等[14]的方法。取凍存的赤霞珠冬芽0.3～0.4 g，充分研磨，分步加入蛋白提取液Ⅰ、Ⅱ萃取蛋白，純白色沉淀冷凍干燥后得到蛋白粗提干粉。稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算粗蛋白質(zhì)產(chǎn)率。

酚抽提方法參考王瑞璞等[15]的方法，有改動(dòng)。取0.1～0.2 g粗蛋白干粉，加入2 mL Tris平衡酚和2 mL SDS Buffer于10 mL小管中；充分渦旋30 s，離心3 min；將上層的酚相吸出，放入一新管中，剩余液體繼續(xù)提取酚相；將冷醋酸銨甲醇溶液加入最終所得的酚相中，放入-20 ℃冰箱靜置沉降30 min取出，離心5 min；將沉淀再用冷醋酸銨甲醇溶液洗2次，再用預(yù)冷的80% 丙酮洗2次后冷凍干燥。蛋白干粉-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

利用CBB G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 雙向凝膠電泳 選用24 cm pH值3～10和17 cm pH值 4～7 這2種規(guī)格IPG預(yù)制膠條(-20 ℃凍存)，設(shè)置400，800 μg蛋白上樣量，加入裂解液充分裂解。將不同處理蛋白液加入GE聚膠槽，預(yù)制IPG膠條膠面朝下吸收12 h樣品溶液。往膠槽緩慢加入2～3 mL礦物油，相鄰2個(gè)膠條槽也要放滿(mǎn)礦物油，夾好電極，設(shè)置第一向等電聚焦程序：250 V快速升壓除鹽1 h，500 V線性升壓除鹽2 h，1 000 V線性升壓除鹽1 h ，4 000 V線性升壓1 h，8 000 V線性升壓1 h ，8 000 V 聚焦48 000 V·h ，1 000 V保持任意時(shí)間。聚焦結(jié)束后，立即平衡膠條，并制備12% 蛋白分離膠，進(jìn)行第二向 SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠，劃邊并切角作記號(hào)(酸性端)。

1.2.3 凝膠染色 熱考馬斯亮藍(lán)R-350染色法：電泳結(jié)束后，將蛋白分離膠放入固定液中，于搖床上緩慢搖動(dòng)30 min進(jìn)行固定。用電磁爐將配制好的R-350凝膠染色液加熱至90～100 ℃[16]，將凝膠放入其中，并置于搖床上緩慢搖動(dòng)15 min進(jìn)行染色，至背景與染液一致。染色結(jié)束后，將凝膠放入配制好的脫色液中，搖床上緩慢搖動(dòng)30 min。脫色液與背景相近，則需更換新鮮的脫色液，重復(fù)3～4次，直到凝膠背景清晰，能看到蛋白點(diǎn)為宜。

冷考馬斯亮藍(lán)R-350、R-250染色法：方法同上，省略掉第2步加熱環(huán)節(jié)，將凝膠直接放入染色液中搖床輕微搖動(dòng)60 min以上。脫色時(shí)過(guò)夜進(jìn)行。

1.3 凝膠圖像掃描和分析

利用ImageScanner Ⅲ 掃描儀掃描SDS-PAGE凝膠圖譜，獲得電子圖像；利用PDQuest Advanced-8.0.1凝膠分析軟件進(jìn)行蛋白點(diǎn)豐度檢測(cè)等圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白提取方法比較

采用TCA-丙酮法和TCA-丙酮法+酚抽提的方法提取赤霞珠葡萄冬芽粗蛋白干粉，結(jié)果表明(表1)，TCA-丙酮法提取赤霞珠冬芽粗蛋白干粉質(zhì)量在0.028 7～0.039 6 g，產(chǎn)率為1%左右，蛋白濃度約為89.450 0 μg/mL；TCA-丙酮法+酚抽提法提取粗蛋白干粉質(zhì)量在0.002 9～0.004 3 g，產(chǎn)率僅占樣本的0.1%左右，蛋白濃度約為187.400 0 μg/mL，表明TCA-丙酮法+酚抽提法所提出的蛋白干粉更純，但產(chǎn)率較低。

表1 不同提取方法赤霞珠冬芽全蛋白質(zhì)量及濃度比較Tab.1 Comparison of total protein quality and concentration of winter buds of Cabernet sauvignon with different extraction methods

利用2種提取方法所得全蛋白粉進(jìn)行雙向凝膠電泳試驗(yàn)，采用pH 值3～10 NL 24 cm IPG膠條，結(jié)果如圖1秘示，綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠葡萄冬芽?jī)?nèi)大多數(shù)蛋白點(diǎn)分布在pH 值 4～7內(nèi)，分子質(zhì)量為20～100 ku。通過(guò)PDQuest凝膠圖譜分析，TCA-丙酮法提取赤霞珠冬芽全蛋白凝膠圖譜上檢測(cè)到699個(gè)蛋白點(diǎn)(圖1-A)，且點(diǎn)的顏色較深，更圓更清晰；而TCA-丙酮法+酚抽提赤霞珠冬芽全蛋白凝膠圖譜上僅檢測(cè)到246個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，并且蛋白點(diǎn)較TCA-丙酮法顏色淺，數(shù)量少(圖1-B)。相較而言，TCA-丙酮提取方法效果更好，蛋白丟失少。

A.TCA-丙酮法全蛋白2-DE圖像；B.TCA-丙酮法+酚抽提全蛋白2-DE圖像。 A.TCA-acetone total protein 2-DE image；B.TCA-acetone+phenol extraction total protein 2-DE image.

2.2 不同蛋白上樣量比較

分別選用400，800 μg粗蛋白上樣量，采用pH值4～7 NL 17CM IPG膠條，水化上樣，進(jìn)行第一向等電聚焦電泳及第二向SDS-PAGE凝膠電泳，利用凝膠掃描儀得到蛋白圖譜，如圖2所示，圖2-A、C為上樣量400 μg凝膠蛋白圖譜，不同分子量蛋白可分辨率高，蛋白點(diǎn)數(shù)多，能進(jìn)行有效的分離。蛋白點(diǎn)圓，邊界清晰；對(duì)于上樣量為800 μg凝膠圖譜(圖2-B、D)，蛋白點(diǎn)可分辨率較低，橫縱向拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，不能進(jìn)行有效分離，蛋白點(diǎn)邊界模糊。

A.綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽400 μg蛋白上樣量的2-DE圖像；B.綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽800 μg蛋白上樣量的2-DE圖像；C.對(duì)照400 μg蛋白上樣量的2-DE圖像；D.對(duì)照800 μg蛋白上樣量的2-DE圖像。A.2-DE image of 400 μg protein loading amount of Cabernet sauvignon winter bud induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of 800 μgprotein loading amount of Cabernet sauvignon winter bud induced by Apolygus lucorum feeding；C.2-DE image of 400 μg protein loading amount；D.2-DE image of 800 μg protein loading amount.

從圖2可以看出，綠盲蝽取食刺激赤霞珠葡萄冬芽的全蛋白凝膠圖譜(圖2-A)和健康葡萄冬芽的蛋白凝膠圖譜(圖2-C)相較，蛋白點(diǎn)數(shù)量、大小、深淺均有很大差異，甚至出現(xiàn)某些蛋白點(diǎn)消失或者增加的現(xiàn)象。利用PDQuest蛋白分析軟件對(duì)比分析，健康的赤霞珠葡萄冬芽(對(duì)照)全蛋白凝膠圖譜上檢測(cè)到543個(gè)蛋白點(diǎn)，而綠盲蝽取食刺激后赤霞珠葡萄冬芽全蛋白凝膠圖譜上檢測(cè)到699個(gè)蛋白點(diǎn)。綠盲蝽取食刺激脅迫后，赤霞珠葡萄冬芽蛋白點(diǎn)明顯增多，部分蛋白含量也發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)差異蛋白。表明綠盲蝽取食刺激可誘導(dǎo)赤霞珠葡萄冬芽蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，產(chǎn)生防御反應(yīng)，其形成的防御蛋白可進(jìn)一步利用質(zhì)譜進(jìn)行差異蛋白定性定量分析。

2.3 不同考馬斯亮藍(lán)染劑比較

2.3.1 R-250、R-350與G-250染色效果比較 雙向電泳技術(shù)中有關(guān)蛋白的染色方法，以考馬斯亮藍(lán)染色法最為常用。本研究采用R-250、R-350與G-250 3種染劑對(duì)聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行染色，對(duì)比分析圖譜效果。R-350染色后圖像背景清晰，對(duì)比度高，蛋白點(diǎn)分辨率高(圖3-A)；R-250染色效果和R-350無(wú)明顯差異(圖3-B)，R-350和R-250均適用于雙向凝膠電泳圖譜染色。從圖3-C可以看出，G-250染色法圖像背景模糊，蛋白點(diǎn)分辨率低，不適用于雙向凝膠電泳圖譜染色。試驗(yàn)結(jié)果表明，R-250、R-350與G-250相比，能得到更高分辨率的凝膠圖像，容易進(jìn)行圖譜分析。

A.綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽全蛋白R(shí)-350染劑2-DE圖像；B.綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽全蛋白R(shí)-250染劑的2-DE圖像；C.綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽全蛋白G-250染劑的2-DE圖像。A.2-DE image of the total protein R-350 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of the total protein R-250 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding；C.2-DE image of the total protein G-250 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding.

2.3.2 熱染法和冷染法染色效果比較 由圖4可知，經(jīng)過(guò)R-350冷染色和加熱染色后的凝膠圖譜背景均較為清晰，蛋白點(diǎn)對(duì)比度高，低濃度蛋白也得到較好的顯現(xiàn)。從染色時(shí)間上比較，采用熱染法比冷染法在染色和脫色時(shí)間上明顯減少。熱染法染色時(shí)間僅需15～20 min，而冷染法則至少需要60～120 min。熱染法不僅縮短了染色時(shí)間，而且凝膠背景清晰，易脫色，脫色時(shí)間不超過(guò)60 min；冷染法需要時(shí)間更長(zhǎng)，需要過(guò)夜脫色。試驗(yàn)結(jié)果表明，綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠葡萄冬芽蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳體系采用熱染法更加省時(shí)高效，且操作簡(jiǎn)單、效果良好。

A.綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽全蛋白R(shí)-350熱染色的2-DE圖像；B.綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠冬芽全蛋白R(shí)-350冷染色的2-DE圖像。A.2-DE image of R-350 hot staining of Cabernet sauvignon winter buds total protein induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of R-350 cold staining of Cabernet sauvignon winter buds total protein induced by Apolygus lucorum feeding.

3 討論與結(jié)論

3.1 蛋白提取方法對(duì)雙向電泳圖譜的影響

植物全蛋白的提取方法種類(lèi)較多，不同材料采用的提取方法也有一定的差異。已有研究結(jié)果顯示，幼嫩組織蛋白提取常采用TCA-丙酮法，酚提取法適用于復(fù)雜樣本的蛋白提取[17-18]。目前報(bào)道的有關(guān)葡萄不同器官中全蛋白的提取方法都各有差異[15，19-20]。本試驗(yàn)提取釀酒葡萄赤霞珠冬芽全蛋白時(shí)，采用了常用提取方法TCA-丙酮法和王瑞璞等[15]提取葡萄種子蛋白的TCA-丙酮法+酚抽提法2種方法，證實(shí)TCA-丙酮法提取蛋白方法簡(jiǎn)單，蛋白不易丟失，蛋白量大，進(jìn)一步進(jìn)行雙向電泳凝膠圖譜效果也較好；而TCA-丙酮法+酚抽提法工藝復(fù)雜，雖然雜質(zhì)去除效果較好，提取蛋白更純，但缺點(diǎn)是蛋白提取量少，蛋白易丟失。這與王瑞璞等[15]對(duì)葡萄種子蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的研究結(jié)果存在明顯差別，表明相同植物不同部位的蛋白質(zhì)含量及提取方法都有所差別。

3.2 蛋白上樣量對(duì)雙向電泳圖譜的影響

蛋白上樣量的大小決定雙向電泳凝膠圖譜的分辨率。索慧英等[21]研究了楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)雙向電泳上樣量對(duì)凝膠圖譜的影響，認(rèn)為上樣量過(guò)小，樣本蛋白點(diǎn)表現(xiàn)的不完全；上樣量過(guò)大，蛋白點(diǎn)過(guò)多，不易分離，多為無(wú)效蛋白點(diǎn)。本研究摸索了適用于赤霞珠葡萄冬芽雙向電泳體系的樣本量，對(duì)于pH值3～10 NL 24 cm和pH值4～7 NL 17 cm 的IPG膠條，上樣量為400 μg蛋白干粉時(shí)，所得凝膠圖譜蛋白點(diǎn)清晰，易于分離；800 μg蛋白上樣量，蛋白點(diǎn)不易分離，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的橫、豎向拖尾現(xiàn)象。

3.3 考馬斯亮藍(lán)染劑對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

考染以其操作簡(jiǎn)便、靈敏度僅次于銀染，且可用于切下蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析等特性，在雙向凝膠電泳技術(shù)中占有重要地位。染色效果好的凝膠圖譜，背景清晰，蛋白點(diǎn)光滑，對(duì)比度高[22]。本試驗(yàn)R-250和R-350 染劑均適合于釀酒葡萄赤霞珠冬芽全蛋白雙向電泳凝膠染色，其中R-350染色是所有染料中唯一可以達(dá)到幾乎無(wú)背景的染色方法，且經(jīng)過(guò)改進(jìn)其染色和脫色時(shí)間大為節(jié)省。G-250染劑則應(yīng)用于蛋白濃度或含量測(cè)定，不適用于SDS-PAGE凝膠圖譜染色。此外，熱染法較冷染法在染色和脫色更為節(jié)省時(shí)間，操作簡(jiǎn)單，且圖像背景清晰度和蛋白點(diǎn)對(duì)比度無(wú)顯著差異。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中建議使用R-350 熱染色法。

3.4 結(jié)論

本研究建立并優(yōu)化了綠盲蝽取食脅迫下赤霞珠冬芽防御反應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)體系，結(jié)果表明，利用TCA-丙酮法抽提蛋白，400 μg蛋白上樣，pH值 4～7 NL 17 cm 的IPG膠條、8 000 V 聚焦48 000 V·h 、G-350熱染色雙向電泳技術(shù)體系得到的赤霞珠冬芽全蛋白凝膠圖譜，符合綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠防御反應(yīng)產(chǎn)生防御蛋白的檢測(cè)要求。綠盲蝽取食刺激脅迫后，赤霞珠葡萄冬芽蛋白點(diǎn)明顯增多，部分蛋白含量也發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)差異蛋白。表明綠盲蝽取食刺激可誘導(dǎo)赤霞珠葡萄冬芽蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，產(chǎn)生防御反應(yīng)。

環(huán)境脅迫條件下植物的不同組織、器官和亞細(xì)胞水平的蛋白表達(dá)水平變化的研究報(bào)道很多[23-26]。植物突變體差異表達(dá)蛋白挖掘、分離、鑒定有助于了解基因和蛋白質(zhì)的功能，在遺傳、毒理、抗逆性、抗藥性分子機(jī)理等方面具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值[27-30]。進(jìn)一步深入研究綠盲蝽取食脅迫下赤霞珠葡萄防御反應(yīng)和保護(hù)機(jī)制的分子基礎(chǔ)，明確其蛋白質(zhì)組水平上的變化，差異表達(dá)蛋白質(zhì)的歸屬、性質(zhì)和功能，篩選與抗性相關(guān)的特異蛋白。并與抗性基因聯(lián)合分析，推測(cè)和驗(yàn)證特異蛋白與抗性相關(guān)基因之間的關(guān)鍵通路，可為揭示綠盲蝽取食誘導(dǎo)赤霞珠抗性反應(yīng)機(jī)制，合理有效地開(kāi)展抗性育種或新型殺蟲(chóng)劑的研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。