氮素營養(yǎng)和根瘤菌接種對(duì)大豆結(jié)瘤固氮和生長的影響

王曉麗，王 敏，岳愛琴，郭數(shù)進(jìn)，王 鵬，王利祥，楊婷婷，張海生，張永坡，高春艷，張武霞，牛景萍，杜維俊，趙晉忠

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 基礎(chǔ)部，山西 太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

氮素是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，在植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)形成過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。因此，提高氮素吸收效率、適當(dāng)增施氮肥是大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要保障。當(dāng)?shù)毓?yīng)不足時(shí)，植物新陳代謝發(fā)生紊亂，體內(nèi)物質(zhì)合成和轉(zhuǎn)化受到影響，氮素利用下降，生長發(fā)育會(huì)受到影響。Chun等[2]研究表明，在低氮誘導(dǎo)下，水稻中葉片的生長素含量上升，另外，根長、根的密度和根冠比增加。低氮脅迫導(dǎo)致植物葉片的光合作用受到抑制，從而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。李強(qiáng)等[3]研究表明，耐低氮玉米能夠緩解低氮脅迫對(duì)光合作用的影響，從而使得較高的氮素含量在植物體內(nèi)積累。孫年喜等[4]研究表明，不同氮素水平對(duì)玉米光合特性具有不同的影響，隨著供氮水平的增加，其光合速率和葉綠素值(SPAD值)均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。當(dāng)植物受到低氮環(huán)境脅迫時(shí)，可將氮素從衰老的葉片中運(yùn)輸?shù)捷^年輕的葉片中，從老葉中輸出的氨基酸用于正在發(fā)育中的幼葉中酶、核苷酶、葉綠素和調(diào)節(jié)蛋白等物質(zhì)的合成，以維持植物正常生長發(fā)育[5]。

豆科植物不僅可以從大氣土壤中吸收氮素營養(yǎng)，還能夠與根瘤菌共生固氮，為其自身提供氮素。大豆作為重要的共生固氮糧食作物，其生長所需氮素營養(yǎng)的50%～90%是由根瘤菌-大豆共生體系固定的，接種根瘤菌后其種子周圍和土壤中的根瘤菌數(shù)量增加，其根部能夠獲得更多根瘤，進(jìn)而提高作物產(chǎn)量[6]。梁福琴等[7]研究表明，在大豆中，當(dāng)?shù)嘏c根瘤菌共同作用時(shí)，其生理指標(biāo)能夠達(dá)到最佳值，使得大豆獲得豐產(chǎn)。研究表明，大豆播種前施用適量氮肥，能夠促進(jìn)根瘤原基形成和根瘤生長，提高土壤中根瘤菌性能，促進(jìn)植株生長，為共生固氮提供有效的碳匯和能量匯[8]。因此，在氮素循環(huán)中，豆科作物與根瘤菌共生固氮互作體系充當(dāng)著非常重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，輕度缺失硝態(tài)氮的情況下能促進(jìn)根系生長，重度缺失硝態(tài)氮或硝態(tài)氮濃度較高時(shí)會(huì)抑制根系生長[9]。而豆科植物共生固氮的特點(diǎn)使其有別于其他植物，Gan等[10]研究不同氮濃度對(duì)大豆結(jié)瘤性狀的影響發(fā)現(xiàn)，氮濃度高于10 mmol/L時(shí)，無論供氮形式是硝態(tài)氮、銨態(tài)氮還是硝酸銨，均顯著降低了大豆根瘤數(shù)、根瘤質(zhì)量以及總固氮量，硝態(tài)氮對(duì)根瘤生長發(fā)育及固氮酶活性抑制作用較銨態(tài)氮更強(qiáng)。

大豆既可通過主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞轿绽猛饨绲貭I養(yǎng)，也可通過其根部特化組織根瘤進(jìn)行共生固氮(Symbiotic nitrogen fixation，SNF)，獲取氮素營養(yǎng)[11]。目前，豆科植物氮素營養(yǎng)的吸收和根瘤菌接種對(duì)大豆結(jié)瘤固氮和生長的影響鮮有研究。

本研究通過對(duì)大豆不同濃度氮處理及接種根瘤菌劑同時(shí)處理，以探究大豆結(jié)瘤固氮情況和不同組織器官中氮素積累情況以及對(duì)葉表型性狀的影響，旨在為大豆氮素高效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大豆品種為Williams 82；大豆根瘤菌株(Bradyrhizobiumjaponicum)采用中國農(nóng)業(yè)大學(xué)CCBAU提供的USDA110。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆溫室進(jìn)行。

1.2.1 根瘤菌株的活化 在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)挑取1環(huán)甘油菌在YMA培養(yǎng)基上劃線，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；后挑取1環(huán)活化后的菌株接種至裝有200 mL YMA培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，并于28 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1 d觀察根瘤菌株USDA110培養(yǎng)液渾濁情況，需要培養(yǎng)5 d左右。

1.2.2 不同氮濃度處理 根據(jù)大豆生長發(fā)育所需氮素營養(yǎng)，以KNO3為氮源，分別設(shè)置無氮(0 mmol/L，NN)、低氮(0.25 mmol/L，LN)和高氮(10 mmol/L，HN)3個(gè)不同濃度的硝酸鹽營養(yǎng)液，將Williams 82分別種植在含有不同濃度硝酸鹽營養(yǎng)液浸濕的蛭石基質(zhì)中，均以不接菌為對(duì)照，3次重復(fù)。

1.2.3 接種根瘤菌處理 蛭石滅菌裝入10 cm×10 cm的營養(yǎng)缽中。將大豆Williams 82于92%的酒精中滅菌5 min，再用5%的NaClO進(jìn)行表面消毒5 min，之后用無菌水清洗10次，于營養(yǎng)液浸濕的蛭石中發(fā)芽(基礎(chǔ)營養(yǎng)液配制參照文獻(xiàn)[12])。7 d之后進(jìn)行間苗，每個(gè)營養(yǎng)缽留有2株長勢(shì)一致的大豆，放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，16 h光/8 h暗，光照溫度25 ℃，黑暗溫度16 ℃，光照強(qiáng)度10 000 lx，相對(duì)濕度70%；待第1片真葉完全展開后，將大豆慢生根瘤菌USDA110(OD600=0.08)輕輕接在大豆幼苗根系周圍，每株大豆接30 mL菌液，分別在接菌后0.5 h(根毛識(shí)別根瘤菌)、1 d(根毛卷曲)、4 d(結(jié)瘤原基形成)、16 d、28 d(2個(gè)結(jié)瘤早期發(fā)育時(shí)期)[13]觀察其結(jié)瘤情況，取葉片、根、根瘤樣品，測(cè)定每個(gè)植株的根干質(zhì)量、根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量，以不接菌為對(duì)照，接種USDA110作參照菌株，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 葉形態(tài)特征的測(cè)定 植物樣品葉片形態(tài)特征采用智能葉面積測(cè)量系統(tǒng)(YMJ-C/CH)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 氮含量的測(cè)定 試驗(yàn)樣品氮含量測(cè)定采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法凱氏定氮法進(jìn)行。將樣品放置在烘箱中105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干，稱取等質(zhì)量樣品，用球磨儀將樣品粉碎，過200 mm篩備用。取樣品0.1 g置于消化管底部，以硫酸銅和硝酸鉀作為催化劑，向消化管中加入3 g的混合催化劑，然后加入5 mL濃硫酸搖勻，消解植物樣品；待消煮管中液體呈現(xiàn)綠色透明顏色時(shí)，將消煮管取下進(jìn)行凱氏定氮法測(cè)定氮含量，在高溫下將植物葉片中的含氮化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，然后用氫氧化鈉堿化，加熱蒸餾出氨，此時(shí)消化管中液體顏色為褐色表明反應(yīng)完全，經(jīng)硼酸吸收后，用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算含氮量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0和Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用R語言進(jìn)行作圖；使用CS 6.0對(duì)試驗(yàn)圖片進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮水平接種根瘤菌對(duì)大豆根瘤數(shù)目、根瘤干質(zhì)量和根干質(zhì)量的影響

待第1片真葉完全展開后，對(duì)不同氮濃度處理的大豆實(shí)生苗接種根瘤菌，28 d后觀察其表型，結(jié)果顯示(圖1)，接種根瘤菌后的結(jié)瘤情況表現(xiàn)為NN>LN>HN，無氮接菌下結(jié)瘤數(shù)最多，隨著氮濃度的增加，根瘤數(shù)逐漸減少。此外，不同氮濃度下根瘤數(shù)目和根瘤干質(zhì)量均呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，無氮處理顯著高于低氮處理(P<0.05)，低氮處理顯著高于高氮處理(P<0.05)(表1)；而根干質(zhì)量呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，無論接菌與不接菌，高氮處理下根干質(zhì)量均顯著高于低氮和無氮處理(P<0.05)，而在低氮和無氮處理間則不存在顯著差異。由不同氮濃度接種根瘤菌對(duì)大豆根系的影響數(shù)據(jù)表明，不同施氮水平對(duì)根瘤數(shù)目、根瘤干質(zhì)量和根干質(zhì)量都有不同程度的影響。

圖1 不同氮濃度處理下接種根瘤菌的結(jié)瘤情況Fig.1 Nodular situation of rhizobia inoculated under different nitrogen concentrations

表1 不同氮濃度下接種根瘤菌對(duì)大豆根部的影響Tab.1 Effect of inoculation of rhizobia with different nitrogen concentration on soybean root

2.2 不同氮水平下接種根瘤菌大豆植株氮素積累變化

在不同施氮水平下，大豆不同器官氮素含量在接種和不接種間表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，且不同器官氮素含量整體呈現(xiàn)葉>根>莖的現(xiàn)象(圖2)。對(duì)于葉組織中氮素含量而言，無論接菌與不接菌，高氮處理下葉組織的氮素含量均顯著高于低氮處理(P<0.05)，而在不接菌的情況下，低氮處理下的氮素含量顯著高于無氮處理(P<0.05)，接菌后二者之間差異不顯著；對(duì)于莖組織的氮素含量，無論接菌與不接菌，其氮素含量在不同氮濃度處理下表現(xiàn)為相同的變化趨勢(shì)，即高氮>低氮>無氮，且差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。根組織中的氮素含量變化趨勢(shì)與葉組織一致。

不同小寫字母表示接菌或不接菌下不同氮水平上存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一氮水平上接菌和不接菌間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicated significant differences between inoculated and non-inoculated nitrogen levels(P<0.05)；Different capital letters indicated significant differences between inoculated and non-inoculated at the same nitrogen level(P<0.05).

2.3 不同氮素水平條件下接種根瘤菌不同葉位葉綠素值(SPAD)的變化

由圖3可知，不同處理?xiàng)l件下，不同葉位SPAD值均呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。除了在接菌下，第1葉的SPAD值表現(xiàn)為HN>LN>NN，且存在顯著差異(P<0.05)外，其他葉位的SPAD值在不同氮水平處理下均為高氮處理顯著高于低氮和無氮處理(P<0.05)，而在低氮和無氮處理之間不存在顯著差異。此外，不同葉位之間SPAD值在不同氮素水平下也呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，其中，在無氮水平下，SPAD值依次為第1對(duì)真葉>第1葉>第2葉，且彼此之間存在顯著差異(P<0.05)；無論在接菌還是不接菌在低氮水平下，第1對(duì)真葉和第1葉時(shí)SPAD值顯著高于第2葉(P<0.05)，而在第1對(duì)真葉和第1葉之間差異不顯著；在接菌情況下，高氮處理的SPAD值在第1葉中含量顯著高于第1對(duì)真葉和第2葉(P<0.05)，說明高氮處理可以促進(jìn)地上部氮素向第1葉轉(zhuǎn)運(yùn)。無論是在不同氮素水平上，還是不同葉位之間，接菌與不接菌都呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，說明接菌不影響葉片之間氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)。

不同小寫字母表示同一氮水平上不同葉位間存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一葉位上不同氮水平間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicated significant differences between different leaf positions at the same nitrogen level(P<0.05)；Different capital letters indicated significant differences between different nitrogen levels at the same leaf position(P<0.05).

從圖4植株的生長狀況也可以看出，高氮處理下植株的長勢(shì)明顯優(yōu)于無氮和低氮處理，且從葉片的顏色也可以看出，無氮和低氮處理葉片整體發(fā)黃，而在高氮處理下，葉片呈現(xiàn)青綠色，尤其是第1葉更為明顯，這也與圖3結(jié)果相吻合。

圖4 不同氮水平條件下接菌后的植株生長Fig.4 Plant growth after inoculation under different nitrogen levels

2.4 不同氮素水平下接種根瘤菌葉形態(tài)指標(biāo)的變化

由表2可知，在不接菌情況下，不同葉位在不同氮素水平上葉形態(tài)指標(biāo)均呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，葉面積、葉周長、葉長和葉寬在低氮和高氮處理均顯著高于無氮處理(P<0.05)；在接菌情況下，第1對(duì)真葉形態(tài)指標(biāo)在不同氮素水平上呈現(xiàn)HN>NN>LN，而第1葉葉面積、葉周長和葉寬在不同氮素水平上沒有顯著差異，第1葉葉長在無氮水平下顯著高于低氮(P<0.05)。在不接菌情況下，葉長在低氮和高氮水平下顯著高于無氮處理(P<0.05)；第2葉的葉面積、葉周長、葉長、葉寬在低氮和高氮水平下均顯著高于無氮(P<0.05)。此外，在同一氮素水平上，不同葉位的葉形態(tài)也表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，在不接菌情況下，無氮處理?xiàng)l件下除了葉長呈現(xiàn)第1葉>第1對(duì)真葉>第2葉外，其他葉形態(tài)指標(biāo)(葉面積、葉周長、葉寬)均表現(xiàn)為第1對(duì)真葉和第1葉顯著高于第2葉(P<0.05)，且第1對(duì)真葉和第1葉之間差異不顯著；而在低氮和高氮處理下，不同葉位之間的葉形態(tài)指標(biāo)(葉面積、葉周長、葉長、葉寬)均差異不顯著；在接菌情況下，在無氮處理下，第1葉的葉面積、葉周長均顯著高于第1對(duì)真葉和第2葉(P<0.05)，第1葉的葉長顯著高于第1對(duì)真葉，第1葉的葉寬顯著高于第2葉(P<0.05)，而在高氮處理下，不同葉位之間差異不顯著。

表2 不同處理下不同葉位的葉形態(tài)指標(biāo)的變化Tab.2 Leaf morphological indexes changes of different leaf positions under different treatments

3 結(jié)論與討論

有研究表明，根瘤數(shù)目和質(zhì)量與施氮量的增加呈負(fù)相關(guān)[14]；但當(dāng)外源氮素水平較高時(shí)，會(huì)對(duì)結(jié)瘤起到抑制作用[15]。本研究為了研究不同氮素水平下接種根瘤菌對(duì)大豆根部及其結(jié)瘤的影響，在幼苗期接種根瘤菌28 d后，對(duì)根干質(zhì)量、根瘤性狀與植物各組織氮含量進(jìn)行測(cè)定表明，隨著施氮量的增加根瘤數(shù)逐漸減少，無氮處理下根瘤最多，高氮處理下根瘤最少；在高氮處理下，大豆根瘤出現(xiàn)氮阻遏現(xiàn)象，可能是由于氮素濃度過高，破壞了根瘤菌菌體結(jié)構(gòu)，降低了固氮酶的活性，抑制了根瘤的生長，這與鄭永美等[16]的研究結(jié)果相一致。此外，過度結(jié)瘤會(huì)導(dǎo)致中午光合作用降低，從而降低總根向蒸發(fā)組織提供水的能力。能夠結(jié)瘤的豆科植物通過蒸騰作用彌補(bǔ)水分損失的能力有限，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，從而降低光合速率[17]；在這種情況下，寄主植物和根瘤之間爭(zhēng)奪碳水化合物的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)加劇，導(dǎo)致植物生長和種子產(chǎn)量進(jìn)一步下降[18]。事實(shí)上，大豆結(jié)瘤固氮和氨同化需要大量的光合作用產(chǎn)物，以提供根系結(jié)瘤所增加的呼吸負(fù)擔(dān)和氮有機(jī)合成所需的碳骨架[19]。無氮處理的根干質(zhì)量最小，根瘤數(shù)最多，而高氮處理的根干質(zhì)量最大，根瘤數(shù)最少。隨著氮濃度的增加，根干質(zhì)量與根瘤數(shù)呈負(fù)相關(guān)，這可能與大豆植株結(jié)瘤減少了根系生物量有關(guān)。有報(bào)道表明，根瘤是較強(qiáng)的碳水化合物匯，因此，根瘤可以減少糖向根細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少根系的生長[20]。

大豆在生育前期，子葉所含的氮素不足以支持大豆生長發(fā)育，而根瘤的固氮作用尚未完全建成，在短時(shí)間內(nèi)會(huì)出現(xiàn)氮素的缺乏，因此，要通過氮素的添加來滿足大豆生長發(fā)育[21]。本研究表明，無論在根、莖還是葉中，氮含量在高氮處理時(shí)均大于低氮處理，低氮處理大于無氮處理。在大豆苗期時(shí)，施氮能夠明顯增加大豆植株前期的氮素積累，氮濃度越高促進(jìn)效果越明顯[22]。不管是接菌還是不接菌處理，葉中氮含量均大于根中氮含量，根中氮含量均大于莖中氮含量。葉綠體是進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，氮素是葉綠素的重要組成成分，適當(dāng)增施氮肥有利于葉綠素的合成，研究表明，葉綠素含量越高，氮含量越高[23]。不接菌時(shí)，低氮處理的葉和莖的氮含量顯著高于無氮處理，接菌后，低氮處理莖的氮含量顯著高于無氮處理，此時(shí)根瘤開始固氮，并向地上部運(yùn)輸。Sun等[24]研究表明，低氮脅迫會(huì)抑制植物葉片的光合作用，葉片所吸收的光能產(chǎn)生了過量的活性氧和丙二醛等物質(zhì)，使植物體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)，生物膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)遭到破壞，植物最終失去光合能力。

有研究表明，較高的葉片氮含量，能夠提高葉綠素含量并參與光合電子傳遞的蛋白質(zhì)水平，提高初級(jí)光化學(xué)反應(yīng)的效率和光合能力[25]。本研究中，在不同葉位，不同接菌處理?xiàng)l件下，高氮處理的SPAD值最大，葉片墨綠，植株高大；低氮與無氮處理，植株矮小，葉片發(fā)黃，分枝變少，這是由于當(dāng)?shù)毓┙o不足時(shí)，植株體內(nèi)核酸、葉綠素、蛋白質(zhì)合成受到阻礙，導(dǎo)致植物出現(xiàn)缺綠癥；降低其光合速率及光合產(chǎn)量。研究表明，氮含量越大，葉綠素含量越大，SPAD值越大[9]。在氮誘導(dǎo)下，氮的積累根據(jù)植株葉片生長程度的不同而存在差別，具體表現(xiàn)為成長中葉片(第1葉)>新生葉片(第2葉)>成熟葉片(第1對(duì)真葉)，植株氮素構(gòu)成的變化直接影響著新生莖、葉氮素構(gòu)成變化，老葉通過葉肉降解，提供給幼葉營養(yǎng)物質(zhì)，維持幼葉正常生長發(fā)育[26]。無氮處理下，不同葉位的SPAD值自下而上依次遞減，此時(shí)，由共生固氮合成的氮素逐漸向缺氮部位轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，葉片性狀是決定植物品質(zhì)的重要因素，主要包括葉面積、葉周長、葉長、葉寬等[27]。有研究表明，良好的群體葉面積指數(shù)、葉面積持續(xù)時(shí)間(光合面積持續(xù)期)、光合勢(shì)是大豆獲得高產(chǎn)的基礎(chǔ)[28]。本研究中，第1葉的葉片性狀最好，與其SPAD值相吻合。在無氮處理?xiàng)l件下，接菌之后，不同葉位葉面積均顯著增加，高于低氮接菌處理；在低氮和高氮處理?xiàng)l件下，接菌之后，葉面積均減少。研究表明，更多的結(jié)瘤提供的更高的氮利用率(氮含量)可以促進(jìn)植物的生長，因?yàn)樯锪康漠a(chǎn)生依賴于氮來合成多種分子，如葉綠素和Rubisco，以及蛋白質(zhì)、核酸和各種酶輔助因子[29]。

綜上所述，大豆共生固氮不需要外界施加過量氮素營養(yǎng)，施氮量越多，根瘤數(shù)越少，共生固氮效果越差。根瘤可以減少糖向根細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少根系的生長；施氮量越多，根瘤數(shù)越少，根干質(zhì)量越大。在大豆苗期，施氮能夠明顯增加大豆植株前期的氮素積累，促進(jìn)葉表型性狀，氮濃度越高促進(jìn)效果越明顯，適當(dāng)增加氮素營養(yǎng)可以提高大豆各器官中氮素的積累量。