食品中多環(huán)芳烴檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

秦正波， 汪橋林， 王 林， 王 晨， 楊新艷， 鄭賢鋒， 崔執(zhí)鳳

(安徽師范大學(xué) 物理與電子信息學(xué)院 光電材料科學(xué)與技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指含有兩個(gè)(含兩個(gè))以上苯環(huán)的芳烴[1]，是一類(lèi)具有毒性的環(huán)境污染物和食品加工污染物，是最先被發(fā)現(xiàn)的有“致畸、致癌、致突變”效應(yīng)的持久型有機(jī)污染物之一。其中含有4～6 個(gè)苯環(huán)的多環(huán)芳烴是最常見(jiàn)的容易致癌的化合物[2]。PAHs主要來(lái)源于有機(jī)物的熱解或不完全燃燒[3]，由人為產(chǎn)生和自然環(huán)境產(chǎn)生，自然源主要來(lái)自陸地、水生植物和微生物的生物合成過(guò)程，另外天然火災(zāi)及火山的噴發(fā)物和從化石燃料、木質(zhì)素還有底泥中也會(huì)產(chǎn)生多環(huán)芳烴；人為源主要是由各種礦物燃料(如煤、石油和天然氣等)、木材、紙以及其他含碳?xì)浠衔锏牟煌耆紵蛟谶€原條件下熱解形成的[4]。而食品中的多環(huán)芳烴污染物來(lái)源于環(huán)境和食品加工過(guò)程的污染。食品的加工過(guò)程被認(rèn)為是食品中PAHs的主要來(lái)源，其加工過(guò)程包括烘干、煙熏、烹調(diào)等[5]。

1976年美國(guó)環(huán)境保護(hù)(Environmental Protection Agency，EPA)根據(jù)環(huán)境中存在的PAHs致癌性和種類(lèi)優(yōu)先監(jiān)測(cè)了16個(gè)PAHs，分別是Ant、Flt、Pyr、BaA、Chr、NaP、Anl、Ane、Flu、Phen、BbF、BkF、BaP、InP、DahA、BghiP，簡(jiǎn)稱(chēng)EPA16[6]。食品中致癌物質(zhì)PAHs發(fā)生的標(biāo)志物苯并(a)芘(benzo(a)pyrene，BaP)是歐盟食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)于2002年所規(guī)定[7]。我國(guó)現(xiàn)行的GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》也把BaP作為食品中PAHs發(fā)生的致癌標(biāo)志物就是依據(jù)于此[8]。六年后EFSA表示食品中PAHs出現(xiàn)的標(biāo)識(shí)物BaP不再是一個(gè)合適的代表。隨后引用了3種新的標(biāo)識(shí)物，分別是PAH2(Chr、BaP)、PAH4(PAH2、BbF、BaA)、PAH8(PAH4、BghiP、BkF、InP和DahA)[9]。并且提出了不同于EPA16的16種食品中的PAHs，簡(jiǎn)稱(chēng)EFSA16(BbF、BaA、Chr、InP、DahA、BkF、BaP、BghiP、BjK、DBahP、CPP、DBaeP、DBaiP、5-MeCh、DBalP和BcF)[10]。在檢測(cè)方面，我國(guó)同歐盟對(duì)食品中的PAH4和BaP做了各自的最大限值規(guī)定，限量值見(jiàn)表1[8, 11-12]。表中加入了暫未實(shí)行的GB 2762—XXXX《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》(征求意見(jiàn)稿)[11]，征求意見(jiàn)稿的發(fā)布日期是2020年8月31日。從表1中不難發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)行版本比，目前的征求意見(jiàn)稿僅僅修改了谷物及其制品中BaP限量要求，尚未建立較為完整的食品中BaP含量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。相比于國(guó)際上對(duì)食品中PAHs的研究和日益完善的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)還處于停滯狀態(tài)，國(guó)內(nèi)目前對(duì)食品中PAHs的危害性評(píng)價(jià)還處于依據(jù)單一的BaP作為標(biāo)識(shí)物[13]。無(wú)論是檢測(cè)的食品種類(lèi)，還是檢測(cè)標(biāo)識(shí)物以及標(biāo)識(shí)物的限量要求都同歐盟有所差距。究其原因是社會(huì)對(duì)食品中PAHs的危害意識(shí)不夠，缺乏重視，致使相關(guān)的檢測(cè)研究相較于歐美國(guó)家較為滯后，有所空缺。因此，為了更好的保障食品安全，嚴(yán)格控制PAHs在食品中的含量，建立完善的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)展和探索更為精確實(shí)用的檢測(cè)手段就顯得十分有意義。因此，本文對(duì)目前的檢測(cè)方法及其檢測(cè)限等內(nèi)容做了探討。

表1 食品中PAH4和BaP最大限值的國(guó)內(nèi)外比對(duì)[8, 11-12]

1 食品中多環(huán)芳烴的提取

食品一般由脂肪類(lèi)化合物、芳香烴、有機(jī)酸和水等成分構(gòu)成，多環(huán)芳烴是非極性物質(zhì)，能使用石油醚、醇類(lèi)、氯仿、苯、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。目前PAHs的主要提取方法有索氏提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、微波輔助萃取等。

1.1 索氏提取法

索氏提取法是一種傳統(tǒng)提取方法。樣品使用的種類(lèi)多，樣品的提取量大，需要純化。其最大的優(yōu)點(diǎn)是回收提取的效率較高。缺點(diǎn)是通常需要連續(xù)提取，耗時(shí)長(zhǎng)，并且溶劑的使用量大，需要嚴(yán)格控制溫度，使用大量有毒的有機(jī)溶劑[14]。因此，索氏提取法通常用于其它方法提取效果的評(píng)價(jià)參考，是因其耗時(shí)長(zhǎng)，提取效率相對(duì)比較高等特點(diǎn)[15-16]。

1.2 超聲波提取法

超聲波提取法的原理是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)和高加速度等效應(yīng)加速提取物進(jìn)入萃取溶劑的方法。對(duì)于提取結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的化合物，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)被超聲波破壞，用此方法是不恰當(dāng)?shù)腫17]。采用超聲波提取方法操作簡(jiǎn)單，提取速度快，溶劑使用量少，且具有較高的回收率。加之PAHs結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，所以食品中多環(huán)芳烴的提取采用超聲波提取法較為常見(jiàn)[18-19]。雖然超聲波常常用于廢水中污染物質(zhì)的降解[20]，但是對(duì)于多環(huán)芳烴這一類(lèi)相對(duì)穩(wěn)定的化合物其影響可以忽略。

1.3 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法(supercritical fluid extraction，SFE)是指利用超臨界流體高擴(kuò)散性和良好的溶解能力來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品中目標(biāo)化合物的萃取分離，具有操作簡(jiǎn)單，回收率相對(duì)較高，提取速度快等特點(diǎn)[21]。并且能夠聯(lián)用各種當(dāng)代分析儀器，如高效液相色譜、氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜等[22-23]。

1.4 微波輔助萃取法

微波輔助萃取法是指用微波對(duì)樣品進(jìn)行加熱,其加熱一些極性溶劑的方法是利用極性分子可迅速吸收微波能量的特點(diǎn)。此方法可以對(duì)萃取物質(zhì)的不同組分進(jìn)行選擇性加熱，選擇性好，速度快。常用于分析土壤中的有機(jī)污染物[24-25]。

對(duì)于提取到的試樣，一般需要根據(jù)PAHs具有的脂溶性和芳香性等特點(diǎn)進(jìn)行濃縮或純化。因?yàn)橐欢康姆欠紵N雜質(zhì)會(huì)不可避免的存在于用有機(jī)溶劑提取的PAHs物質(zhì)中，這對(duì)定量檢測(cè)PAHs會(huì)帶來(lái)一定的干擾。這里不在贅述純化方法。

2 食品中PAHs的檢測(cè)

提取和純化后得到的試樣，需要借助一些專(zhuān)業(yè)儀器進(jìn)行分析。目前，測(cè)定食品中多環(huán)芳烴含量的方法主要有高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)法以及氣相色譜(gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID)法等。通過(guò)調(diào)研國(guó)內(nèi)對(duì)食品中多環(huán)芳烴的檢測(cè)，自2018年以來(lái)，部分研究者們用HPLC法和GC-MS法測(cè)定PAH4的定量限和檢出限見(jiàn)表2。

表2 GC-MS法和HPLC法測(cè)定PAH4的檢出限、定量限和平均回收率

從表2我們可以看出，在烤肉的PAH4的測(cè)定中，HPLC和GC-MS的檢測(cè)效果相差不大，有的化合物(苯并(b)熒蒽(BbF))GC-MS法的效果較優(yōu)于HPLC，但是總體上HPLC稍好一些。但在植物油的PAH4檢測(cè)中，HPLC法檢出限和定量限分別為(0.05～0.1)μg/kg和(0.17～0.33)μg/kg，GC-MS法檢出限和定量限分別為(0.21～0.52)μg/kg和(0.70～1.74)μg/kg，GC-MS法比HPLC法高了近一個(gè)數(shù)量級(jí)。顯然，在測(cè)定植物油中PAH4時(shí)HPLC-FLD法的靈敏度優(yōu)于GC-MS法。從三個(gè)加標(biāo)(5.0、10.0、20.0μg/kg)下的平均回收率來(lái)看，兩種方法的準(zhǔn)確度均滿(mǎn)足分析的要求?？荡湫繹31]等人用以上兩種方法測(cè)定食用油中的PAH4含量也得到了上述結(jié)論。下面分別對(duì)兩種常用方法進(jìn)行介紹。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是PAHs的常規(guī)檢測(cè)方法。王鐘等[19]建立了水果和蔬菜中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴(European priority controlled polycyclic aromatic hydrocarbons，EU-PAHs)時(shí)采用了高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)的同時(shí)測(cè)定方法。利用超聲波輔助乙腈提取蔬菜和水果中的15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴。用乙腈-水作流動(dòng)相梯度洗脫，采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，按照選定的色譜條件，15種EU-PAHs 在50min內(nèi)達(dá)到基線分離，方法的精密度為4.2%～12.0%，方法回收率83.6%～97.2%。15種EU-PAHs 的線性范圍為0.2～8.0μg/kg，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

王溪等[33]采用裝有Bio-Beads S-X3填料的凝膠滲透色譜凈化分離柱，建立了生肉中歐盟優(yōu)控15種多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法。采用PAH C18反相鍵合固定相色譜柱分離，也采用水和乙腈進(jìn)行梯度洗脫，高效液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明15種多環(huán)芳烴在0.2～20.0ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)[苯并(j)熒蒽：0.5～20.0ng/mL]線性良好(R>0.998)，該方法定量限為0.12～1.51μg/kg，檢出限為0.04～0.49μg/kg。分別添加3個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5、2.0、10.0μg/kg)在雞肉、生魚(yú)肉、牛肉和豬肉4種基質(zhì)中，平均回收率為61.0%～101.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～11.5%(n=6)。

綜上，高效液相色譜法無(wú)論是針對(duì)水果、蔬菜還是肉類(lèi)都取得了良好的結(jié)果，滿(mǎn)足定量分析的要求。也是目前較為主流的檢測(cè)方法之一。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜法

近年來(lái)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)日益完善，已經(jīng)成為食品中PAHs檢測(cè)的常用方法。在某些國(guó)家，常規(guī)的多環(huán)芳烴檢測(cè)分析手段就是GC-MS法，在定性定量分析食品中PAHs中該方法已成為有效的手段之一。質(zhì)譜法的優(yōu)點(diǎn)就是可在多種有機(jī)化合物同時(shí)存在的情況下對(duì)其進(jìn)行定性定量分析，尤其適合于多環(huán)芳烴分析。王國(guó)慶等人[26]通過(guò)檢測(cè)食用植物油中三十種多環(huán)芳烴建立了冷凍除脂-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法。選用6種氘標(biāo)記PAHs為內(nèi)標(biāo)，樣品經(jīng)乙腈-丙酮溶液于離心管中渦旋提取，以二氯甲烷復(fù)溶，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)30種PAHs均有良好線性(R2>0.998)，檢出限為0.10～1.83μg/kg，定量限為0.35～6.11μg/kg，在5、20和50μg/kg添加水平下的回收率為67.77%～119.28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%～12.47%。用此方法對(duì)市售11類(lèi)38個(gè)食用植物油樣品的檢測(cè)也取得了良好的效果。

毛婷等[34]建立了一種用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定燒烤肉制品中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的方法。對(duì)目標(biāo)化合物使用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。用環(huán)己烷作溶劑，使用凝膠凈化萃取液去除大分子脂肪酸，進(jìn)一步凈化是通過(guò)硅膠固相萃取柱，經(jīng)環(huán)己烷洗脫。方法的檢出限為0.20～0.91μg/kg。對(duì)所有目標(biāo)化合物，方法線性關(guān)系均良好(R>0.99)，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于10%。在10μg/kg和20μg/kg添加水平下，15種PAHs平均回收率為72.6%～96.9%。用此方法對(duì)市售的5個(gè)燒烤肉制品進(jìn)行檢測(cè)，樣品中PAHs濃度為0.87～19.52μg/kg。

此外，食品中常見(jiàn)的檢測(cè)方法還有熒光光譜法、酶聯(lián)免疫分析方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)以及氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)技術(shù)等。某些物質(zhì)受可見(jiàn)光或紫外光照射激發(fā)后能發(fā)射出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。即某些化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量(如光能、化學(xué)能等)從而到達(dá)激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)落回基態(tài)時(shí)，剩余的能量以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)這便產(chǎn)生了熒光，也就是熒光光譜法的原理。熒光光譜法在食品分析中的應(yīng)用已有報(bào)道[35-36]。但熒光光譜法常常與高效液相色譜聯(lián)用，用于測(cè)定土壤中的多環(huán)芳烴[37]，用于食品中PAHs檢測(cè)有快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)限過(guò)高[38]。酶聯(lián)免疫分析方法雖然靈敏度較好，準(zhǔn)確性較高；但是相對(duì)于GC-MS方法，后者的重現(xiàn)性較好，檢測(cè)更為穩(wěn)定。近年來(lái)，ELISA更多的是用在食品中的農(nóng)藥殘留等檢測(cè)上[39-40]。氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)常用于檢測(cè)農(nóng)藥殘留[41-42]，在近年的文獻(xiàn)報(bào)道中該技術(shù)在檢測(cè)食品中的多環(huán)芳烴時(shí)取得了不錯(cuò)的效果，邢燕等[43]測(cè)定方便面中十六種多環(huán)芳烴建立了固相萃取-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)定量限在0.03～0.54μg/kg之間。許婷等[44]測(cè)定食用油中18種多環(huán)芳烴建立了同位素稀釋氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的方法，線性范圍為1～200μg/kg時(shí)，該方法線性關(guān)系良好(R2=0.999)，檢出限為0.03～0.27μg/kg，定量限為0.10～0.89μg/kg。添加水平在5、10、50μg/kg時(shí)，前處理回收率為67.9%～100.8%，精密度(n=3)為0.5%～8.7%。說(shuō)明氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在檢測(cè)食品中的多環(huán)芳烴時(shí)效果良好。但該方法會(huì)受限于溫度的影響。

2.3 PAHs的檢測(cè)難點(diǎn)

綜上所述，食品中的PAHs的檢測(cè)難點(diǎn)主要集中在三個(gè)方面。首先是食品的種類(lèi)繁多。食品中肉類(lèi)、谷物、水果、油脂等食物，由于其物質(zhì)屬性的不同，在使用檢測(cè)方法上就不能一概而論。表2我們類(lèi)比了兩種不同的食品(烤肉和植物油)在幾種不同的PAHs檢測(cè)方法下的檢出限和定量限，顯而易見(jiàn)的是HPLC法在測(cè)定植物油中PAH4時(shí)的靈敏度遠(yuǎn)優(yōu)于GC-MS法。但HPLC-FLD也存在缺陷，某些多環(huán)芳烴不適用于熒光吸收，從而導(dǎo)致HPLC-FLD法只能夠測(cè)定有限種類(lèi)的多環(huán)芳烴[45]。這也就是檢測(cè)難點(diǎn)的第二點(diǎn)，PAHs的種類(lèi)也較多[10]，沒(méi)有一種方法能良好的應(yīng)對(duì)所有的PAHs。再者是基質(zhì)復(fù)雜，PAHs不易提取，誤差大。不同的檢測(cè)方法需要配合不同的前置提取方法才能發(fā)揮一個(gè)較好的效果，沒(méi)有一個(gè)較為統(tǒng)一的處理程序。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，盡管?chē)?guó)標(biāo)采用的是高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法，其測(cè)量精度高，易于重現(xiàn)，相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)十分有優(yōu)勢(shì)，適合于多環(huán)芳烴分析。但是兩種方法的缺點(diǎn)體現(xiàn)在靈敏度受檢測(cè)儀器所限，樣品前期處理相對(duì)復(fù)雜，對(duì)基層進(jìn)行便捷快速的檢測(cè)十分不利。因此，熒光光譜法、酶聯(lián)免疫分析法也就具有了一席之地，前者靈敏度高，所以受干擾因素也多，溶劑不純會(huì)帶入較大誤差。后者存在重現(xiàn)性和準(zhǔn)確定量方面不及其他方法的問(wèn)題。

3 總結(jié)

多環(huán)芳烴已成為世界各國(guó)共同關(guān)注的有機(jī)污染物，越來(lái)越多的人開(kāi)始重視食品中PAHs的含量。為保障食品安全，對(duì)食品中PAHs含量的測(cè)定顯得非常重要。本文概述了食品中PAHs檢測(cè)的常見(jiàn)前處理方法，對(duì)比了我國(guó)同歐美國(guó)家關(guān)于食品中PAHs的含量限值、以及各種PAHs測(cè)定方法的優(yōu)劣。PAHs較為穩(wěn)定，結(jié)合各個(gè)提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)來(lái)看，超聲波提取法是當(dāng)前行之有效的方法，具有操作簡(jiǎn)單，回收相對(duì)較高等特點(diǎn)，其容易破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)又對(duì)PAHs的影響可忽略，也是當(dāng)下比較常用的PAHs提取辦法。

在測(cè)定環(huán)節(jié)，盡管現(xiàn)有的檢測(cè)方法繁多，但又各自存在短板。需要根據(jù)不同測(cè)定目的和測(cè)定目標(biāo)，選用適宜的檢測(cè)方法，這給檢測(cè)的高效、便捷帶來(lái)了阻礙。盡管高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法是當(dāng)下定性定量分析食品中PAHs的有力工具，但同時(shí)也存在短板，因此在沒(méi)有新方法面世之前，多種檢測(cè)手段互補(bǔ)，是較好的應(yīng)對(duì)途徑。綜上，關(guān)于PAHs的檢測(cè)國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的研究還是較少，為我國(guó)建立較為權(quán)威的食品中PAHs限制標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)識(shí)物帶來(lái)了困難。隨著人們對(duì)食品中PAHs更多的關(guān)注，發(fā)展和探尋新技術(shù)、建立新標(biāo)準(zhǔn)具有很大前景和實(shí)際意義。