外周血PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病遺傳易感性研究*

李 偉，黃 宇，鐘 璟，韋 雋

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種常見的肝病，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率大約為25%[1]。隨著肥胖、2型糖尿病和高血壓等發(fā)生率不斷上升，NAFLD患病率亦呈上升趨勢(shì)[2]。NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不明確，通常認(rèn)為是由遺傳因素和環(huán)境因素等多種因素共同作用所致[3]。不斷有研究指出，基因多態(tài)性與NAFLD遺傳易感性有關(guān)[4]。patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域蛋白3(patatin like phospholipase domain containing protein 3，PNPLA3)是patatin樣磷脂酶家族成員之一。國(guó)外文獻(xiàn)[5,6]報(bào)道，PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性與NAFLD患病有關(guān)。但國(guó)內(nèi)有關(guān)PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性與NAFLD遺傳易感性的報(bào)道并不多見。本研究通過分析外周血PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性探討了其與NAFLD遺傳易感性關(guān)系，旨在為發(fā)現(xiàn)我國(guó)NAFLD患者新的遺傳危險(xiǎn)因素，從而為盡早識(shí)別易感人群提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年11月～2019年11月我院診治的NAFLD患者162例，男性52例，女性110例；年齡為33～71歲，平均年齡為(52.1±9.1)歲。NAFLD診斷符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南 (2018年版)》的標(biāo)準(zhǔn)[7]，影像學(xué)檢查確定存在脂肪肝的表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、病毒性肝炎；(2)嚴(yán)重的器質(zhì)性疾??；(3)長(zhǎng)期飲酒且酒精攝入量為男性>140 g/周，女性>70 g/周。選擇同期體檢的健康人群100例，男性36例，女性64例；年齡為32～72歲，平均年齡為(52.5±9.3)歲。納入健康人群無糖尿病、心臟病、高血壓、肝腎功能異常和不飲酒。兩組研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究方案符合《赫爾辛基宣言》及其準(zhǔn)則，并通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 臨床資料的收集 收集入選對(duì)象性別、年齡、身高、體質(zhì)量、腰圍和臀圍，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)，腰臀比=腰圍(cm)/臀圍(cm)。常規(guī)檢測(cè)血生化指標(biāo)。

1.3 外周血PNPLA3 rs738409基因測(cè)序和分型 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法檢測(cè)外周血PNPLA3 rs738409位點(diǎn)多態(tài)性，取外周靜脈血3 mL，立即置入EDTA抗凝管中，采用全血基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)于深圳子科生物科技有限公司)提取基因組DNA。調(diào)整DNA濃度為50 ng/ μL，行PCR擴(kuò)增(試劑盒購(gòu)于上海百奧生物科技有限公司)，PCR擴(kuò)增體系為：Taq Buffer 5.0 μL，10mM dNTP 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板1.0 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，ddH2O 10.5 μL，總體積為20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃終止延伸10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳和純化，將純化產(chǎn)物送至上海生工有限公司測(cè)序(美國(guó)ABI公司的ABI PRISM3730測(cè)序儀)，從而確定該樣本的基因型。PNPLA3 rs738409位點(diǎn)上游引物：5＇-CCTGAAGTCCGAGGGTGT-3＇，下游引物：5＇-CGGGTAGCCTGGAAATAG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為387 bp，引物由上海生工有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 NAFLD組體質(zhì)指數(shù)、腰臀比以及血清TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、GGT和ALP水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05，資料未列出)。

2.2 PNPLA3基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡情況 PNPLA3 rs738409位點(diǎn)基因型包括GG、GC和CC型三種基因型。經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，NAFLD組與對(duì)照組人群PNPLA3基因分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性(P>0.05，表1)。

表1 PNPLA3基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(%)分析

2.3 兩組PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)多態(tài)性分布比較 NAFLD組PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)GG基因型和G等位基因分布頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05，表2)。

2.4 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血生化指標(biāo)比較 不同PNPLA3 rs738409基因型的NAFLD患者血清ALT和AST水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GG和GC基因型NAFLD患者血清ALT和AST水平顯著高于CC基因型NAFL患者(P<0.05，表3)。

2.5 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血脂和相關(guān)指標(biāo)比較 GG和GC基因型NAFLD患者血清TG水平顯著高于CC基因型NAFLD患者(P<0.05)，GG基因型血清TG水平顯著高于GC基因型(P<0.05，表4)。

表2 兩組PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)基因型分布(%)比較

表3 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血生化指標(biāo)比較

表4 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血脂和相關(guān)指標(biāo)比較

3 討論

NAFLD是一種常見的慢性肝病。在過去幾十年間，我國(guó)NAFLD發(fā)病率呈現(xiàn)不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且越來越低齡化，可能與我國(guó)人口飲食結(jié)構(gòu)、生活方式轉(zhuǎn)變和物質(zhì)生活水平提高關(guān)系密切[8]。有證據(jù)[9]表明，NAFLD與肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合征和遺傳多態(tài)性密切相關(guān)，是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。目前認(rèn)為，NAFLD發(fā)病經(jīng)典機(jī)制為肝臟“二次打擊”學(xué)說，基于肝細(xì)胞內(nèi)TG過度沉積的“初次打擊”和由炎癥因子、氧化應(yīng)激同時(shí)參與的進(jìn)一步加重肝細(xì)胞壞死所引起的肝纖維化過程。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)研究分析和候選基因研究從分子水平上加深了對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制的理解[10]。

PNPLA3位于22q13.31，編碼一個(gè)481個(gè)氨基酸組成的非分泌性蛋白，具有酰基水解酶活性，屬于非Ca2+依賴的patatin樣磷脂酶家族[11]。PNPLA3在N端具有類似于patatin的結(jié)構(gòu)域，即高度保守序列Gly-X-Ser-X-Gly，對(duì)甘油(三酰甘油、二?；视秃蛦熙；视?具有水解酶活性，在脂代謝穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。PNPLA3基因在人體肝臟組織表達(dá)最豐富，但PNPLA3蛋白的生物學(xué)功能尚未完全闡明。國(guó)外已開展的研究表明PNPLA3基因rs738409多態(tài)性與NAFLD遺傳易感性有關(guān)，但其影響NAFLD的具體作用機(jī)制有待深入探究。全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示，PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)C>G是拉美裔、非裔美國(guó)人和歐洲裔美國(guó)人NAFLD發(fā)生的危險(xiǎn)因素[13]。對(duì)多個(gè)種族人群的進(jìn)一步研究證實(shí)了PNPLA3 rs738409 I148M對(duì)NAFLD易感性的影響[14,15]。本研究結(jié)果顯示，NAFLD患者PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)GG基因型和G等位基因分布頻率顯著高于健康人群，編碼GG基因型和G等位基因攜帶者NAFLD遺傳易感性明顯增加。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PNPLA3蛋白具有水解甘油三脂的生物學(xué)功能，但其在體內(nèi)的生物學(xué)活性尚不明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[16]表明，PNPLA3對(duì)小鼠肝臟甘油三酯水解具有抑制作用。此外，與PNPLA 3(I148M)相關(guān)的脂肪變性是由PNPLA3在肝臟脂滴上的積累引起的，PNPLA3在肝臟脂滴上的積聚是肝臟脂肪變性的基礎(chǔ)[17]。故PNPLA3蛋白可能更多參與脂肪合成過程而非脂肪分解過程，而PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)C突變?yōu)镚，導(dǎo)致148位異亮氨酸突變?yōu)榈鞍彼?，PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)多態(tài)性改變了PNPLA3蛋白活性中心結(jié)構(gòu)，使得酶活性中心被掩蓋，進(jìn)而影響脂肪合成和水解過程，最終導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積。研究[18]也表明，PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)非同義替換突變(C>G)與肝臟脂肪沉積增加具有相關(guān)性，GG基因型人群肝臟脂肪含量顯著升高。文獻(xiàn)研究[19]亦發(fā)現(xiàn)，PNPLA3特定位點(diǎn)點(diǎn)突變可顯著影響PNPLA3蛋白功能活性，其中最重要的突變即為PNPLA3 rs738409位點(diǎn)突變，且G等位基因發(fā)生肝硬化的幾率是C等位基因的3.9倍，G等位基因與脂肪變性、小葉炎癥、NAFLD活性評(píng)分和纖維化也有顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，GG和GC基因型NAFLD患者血清ALT、AST、TG水平顯著高于CC基因型NAFLD患者，GG基因型高于GC基因型，故攜帶GG和GC基因型NAFLD患者肝功能損傷可能更加嚴(yán)重，其TG水平更高，肝臟脂質(zhì)積累更多。PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)等位基因C突變?yōu)镚，削弱其對(duì)脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致脂質(zhì)異位沉積和胰島素抵抗。血清ALT和AST水平上升可能與攜帶GG和GC基因型NAFLD患者肝細(xì)胞損傷以及肝臟炎癥活動(dòng)更加嚴(yán)重有關(guān)。但三種基因型NAFLD患者血清GGT、ALP、HDL-C、LDL-C、BMI、腰臀比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性與NAFLD疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系可能較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。一項(xiàng)分析PNPLA3 rs738409多態(tài)性與NAFLD易感性的研究[20]發(fā)現(xiàn)，PNPLA3 rs738409位點(diǎn)CG/GG基因型增加了巴西受試者NAFLD患病風(fēng)險(xiǎn)，且PNPLA3 rs738409位點(diǎn)GG基因型與非酒精性脂肪性肝炎患者肝酶升高和纖維化有關(guān)?？傊珿等位基因可能是NAFLD遺傳易感性的重要影響因素，即PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性與NAFLD遺傳易感性存在關(guān)聯(lián)性。研究報(bào)道[21]表明，PNPLA3 I148M變異體與NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，CG基因型增加發(fā)病機(jī)會(huì)2.092倍，GG基因型增加4.566倍。故PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性可能在NAFLD發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但PNPLA3 rs738409基因突變可能并不僅僅是單純的功能喪失，其能否單獨(dú)引起脂肪肝還有待深入研究。通過深入研究PNPLA3基因在NAFLD發(fā)病過程中的作用機(jī)制，為深入闡明NAFLD遺傳易感性及其發(fā)病的分子機(jī)制提供了新的方向，從而有助于篩選NAFLD高危人群，做到盡早預(yù)防、診斷和個(gè)體化治療。

綜上所述，PNPLA3 rs738409基因多態(tài)性與NAFLD遺傳易感性有關(guān)。該項(xiàng)研究將有助于指導(dǎo)盡早識(shí)別NAFLD易感人群，從而為NAFLD防治提供方向。