敲低miR-21-3p抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

陳彬彬，陳 丹

[湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院）呼吸三科，湖南 長沙 410016]

微小核糖核酸（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為20～23個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，通過和靶基因mRNA堿基配對，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，與多種腫瘤的發(fā)生均密切相關(guān)[1]。miR-21-3p生物學(xué)功能多樣，包括調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及分化等過程。隨著研究的深入，miR-21-3p可能成為新的腫瘤標(biāo)志物，并為腫瘤的基因治療提供新靶點[2]。然而，miR-21-3p調(diào)控非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）的詳細(xì)機制仍有待進一步研究。CTD小磷酸酶樣蛋白（CTDSPL）是一種抑癌基因，其在各種原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤中常被發(fā)現(xiàn)失活[3]。本研究旨在探討miR-21-3p對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，以及其與CTDSPL的初步關(guān)系，現(xiàn)將研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本收集2018年5月至2019年12月湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院）收治的未進行過放化療并接受腫瘤切除術(shù)的16例T2期NSCLC患者的腫瘤組織和癌旁組織。本研究經(jīng)院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞正常人肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）和NSCLC細(xì)胞株A549和H1975均來自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.3 主要試劑胎牛血清和洛斯維公園紀(jì)念研究所 -1640（RPMI-1640）培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；miR-21-3p模擬物（mimic） / 抑制劑（inhibitor）和陰性對照（miR-NC）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipofectamine 2 000試劑和Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；靶向抑制CTDSPL表達的shRNA（sh-CTDSPL）和陰性對照載體（sh-Con）（上海生工生物工程股份有限公司）；PrimeScript RT試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；端粒酶活性熒光實時定量PCR法檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT）試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5- 乙炔基 -2’- 脫氧尿苷（EDU）細(xì)胞增殖分析試劑盒、4',6- 二脒基 -2- 苯基吲哚（DAPI）試劑（廣州銳博生物科技有限公司）；CTDSPL抗體（英國Abcam公司）；HRP- 綴合的兔 / 小鼠抗 -IgG（美國Proteintech公司）；p-MIR-reporter質(zhì)粒（美國Ambion公司）；熒光素酶測定試劑盒（美國Promega Corporation公司）。

1.1.4 主要儀器蛋白質(zhì)Western blot印跡系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：Tanon V8）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海易孛特光電技術(shù)有限公司，型號：eBlot Touch Imager）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司，型號：SpectraMax iD3）；實時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司，型號：ABI 7500）；熒光分析儀（美國Thermo Scientific公司，型號：Fluoroskan Ascent FL）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組將BEAS-2B、A549和H1975細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1 640培養(yǎng)基中，并置于37 °C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)期A549細(xì)胞，接種于96孔板，次日細(xì)胞達到80%融合時，改用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，然后按照說明書步驟進行轉(zhuǎn)染，將20 nmol/L的miR-21-3p inhibitor和miR-NC轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，命名為miR-21-3p inhibitor組和miR-NC組。取已轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-21-3p inhibitor的A549細(xì)胞，按照上述方法，用lipofectamine 2 000試劑將10 nmol/L的sh-Con或sh-CTDSPL分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞，分別命名為miR-NC+sh-Con組、miR-21-3p inhibitor+sh-Con組及miR-21-3p inhibitor+sh-CTDSPL組。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測肺癌組織和肺癌細(xì)胞株中miR-21-3p的相對表達量使用Trizol試劑從臨床肺癌腫瘤組織、癌旁組織及細(xì)胞系（BEAS-2B、A549和H1975細(xì)胞）中提取RNA，并通過PrimeScript RT試劑盒合成cDNA。按照端粒酶活性熒光實時定量PCR法檢測試劑盒說明書步驟，分別取目的基因正向和反向引物（各0.3 μM）、2×Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（12.5 μL）、TERT 正向和反向引物（各1.0 μM）、cDNA（200 ng）和無核酸水混勻（總體積25 μL），然后在實時PCR系統(tǒng)上進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序設(shè)定為95 ℃總變性10 min，然后進行40個循環(huán)（95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性30 s和72 ℃延伸 30 s）。miR-21-3p 上游引物：5′-ACACTCCAGC TGGGCAACACCAGTCGATGGGC-3′，miR-21-3p 下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。用 U6 作為 miR-21-3p的內(nèi)部參照，用2-ΔΔCt法計算miR-21-3p的相對表達量。取三份樣品做3次獨立實驗，取平均值作為實驗結(jié)果。

1.2.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力將各組細(xì)胞接種到96孔板中（5×103細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24 h后，棄舊的培養(yǎng)基，每孔加入濃度為5 mg/L的MTT試劑（20 μL），并繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入150 μL二甲基亞砜在室溫下溶解15 min。使用酶標(biāo)儀記錄每孔在波長570 nm處的吸光度值。細(xì)胞活性（%） = （觀察組吸光度值/陰性對照組吸光度值）×100%。每組細(xì)胞均設(shè)4個復(fù)孔，取均值作為一次獨立實驗的結(jié)果。均進行3次獨立實驗。

1.2.2.3 EDU摻入法測定細(xì)胞增殖將各組細(xì)胞接種到96孔板中（1×103細(xì)胞/孔），加入50 μmol/L EDU孵育4 h，用PBS洗去未滲入的EDU，將細(xì)胞用固定液固定15 min后，用0.5% TritonX-100透過細(xì)胞5 min，加入100 μL Apollo染色液避光染色30 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用DAPI染核5 min，熒光顯微鏡觀察并計數(shù)EDU陽性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。EDU陽性細(xì)胞率以每個視野下EDU陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率表示。每組細(xì)胞均設(shè)3個復(fù)孔，每孔隨機選3個視野，取均值作為一次獨立實驗的結(jié)果。均進行3次獨立實驗。

1.2.2.4 Transwell測定細(xì)胞的遷移與侵襲細(xì)胞以1×105/mL重懸于無血清的培養(yǎng)基中。遷移的測定：取200 μL細(xì)胞懸液添加到含8 μm孔徑的聚碳酸酯膜的Transwell小室中，并將500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到Transwell板孔中，培養(yǎng)24 h后，擦除小室膜上層面的細(xì)胞，然后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照并計數(shù)。對于侵襲測定，采用基質(zhì)膠包被的聚碳酸酯膜，其余步驟同細(xì)胞遷移的實驗方法。均進行3次獨立實驗。

1.2.2.5 熒光素酶報告基因檢測miR-21-3p與CTDSPL的靶向關(guān)系分別將人CTDSPL的整個3'-UTR（WT）和CTDSPL 3'-UTR突變片段（Mut）克隆到p-MIR-reporter質(zhì)粒中。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟，分別用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染W(wǎng)T或Mut螢火蟲熒光素酶報道質(zhì)粒（0.3 μg），并轉(zhuǎn)染20 nmol miR-21-3p mimic和miR-NC或者miR-21-3p inhibitor和miR-NC。轉(zhuǎn)染48 h后，通過熒光素酶測定試劑盒對熒光素酶含量進行測定。均進行3次獨立實驗。

1.2.2.6 Western blot檢測CTDSPL的蛋白表達將細(xì)胞采用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液裂解并提取蛋白，用BCA試劑盒對蛋白定量后，進行蛋白電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂乳封閉45 min，并在4 ℃下孵育一抗CTDSPL（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）過夜，隨后用PBST洗膜5次，并與HRP- 綴合的兔/小鼠抗 -IgG（1∶10 000）在室溫下孵育2 h。用PBST洗膜5次后，用化學(xué)發(fā)光成像檢測系統(tǒng)顯像，拍照蛋白條帶，用Image J軟件檢測條帶吸光度值，蛋白相對表達量=（目標(biāo)蛋白吸光度值/內(nèi)參GAPDH蛋白吸光度值）×100%。均進行3次獨立實驗。

1.3 觀察指標(biāo)①miR-21-3p相對表達量。對比肺癌組織、癌旁組織及BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞（A549、H1975）中miR-21-3p相對表達量。②敲低miR-21-3p表達對肺癌A549細(xì)胞細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。以肺癌A549細(xì)胞為研究細(xì)胞株，對比miR-21-3p inhibitor組和miR-NC組A549細(xì)胞中miR-21-3p的相對表達量、細(xì)胞活性、EDU陽性細(xì)胞、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。③熒光素酶報告基因檢測miR-21-3p與CTDSPL的靶向關(guān)系。④CTDSPL蛋白表達情況。對比BEAS-2B、A549細(xì)胞及miR-21-3p inhibitor組和miR-NC組A549細(xì)胞中CTDSPL蛋白相對表達水平。⑤敲低miR-21-3p表達通過CTDSPL降低A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。對比miR-NC+sh-Con組、miR-21-3p inhibitor+sh-Con組及miR-21-3p inhibitor+sh-CTDSPL組A549細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移及侵襲。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以(±s?)表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，均數(shù)的兩兩比較采用事后Bonferroni校正。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC肺癌組織和癌旁組織中miR-21-3p相對表達量與癌旁組織[（100.45±8.89）%]相比，在NSCLC肺癌組織中miR-21-3p相對表達量[（234.78±18.76）%]顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞（A549和H1975）中miR-21-3p相對表達量與BEAS-2B細(xì)胞[（98.67±28.34）%]相比，A549[（536.43±21.49）%]和 H1975 細(xì)胞[（379.21±41.54）%]中 miR-21-3p相對表達量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 敲低miR-21-3p表達對肺癌A549細(xì)胞細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響經(jīng)比較BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞株A549和H1975中miR-21-3p表達后，選擇表達差異更為明顯的A549進行后續(xù)實驗。結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-21-3p inhibitor組細(xì)胞中miR-21-3p相對表達量顯著降低，細(xì)胞活性和EDU陽性細(xì)胞率均顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1、圖1和圖2。

表1 敲低miR-21-3p表達降低A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲(?±s?)

表1 敲低miR-21-3p表達降低A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲(?±s?)

注：EDU：5- 乙炔基 -2’- 脫氧尿苷。

組別 例數(shù) miR-21-3p相對表達量(%) 細(xì)胞活性(%) EDU陽性細(xì)胞(%) 遷移細(xì)胞數(shù)(個) 侵襲細(xì)胞數(shù)(個)miR-NC 組 3 100.12±5.38 98.75±14.68 25.12±4.75 226.58±18.74 118.24±11.35 miR-21-3p inhibitor組 3 28.45±9.86 51.23±4.94 7.74±2.61 94.35±15.76 44.38±7.41 t值 21.369 13.452 15.673 12.684 17.752 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 各組A549細(xì)胞EDU熒光染色圖（×200）

圖2 各組A549細(xì)胞遷移與侵襲的Transwell圖（×200）

2.4 熒光素酶報告基因檢測miR-21-3p與CTDSPL的靶向關(guān)系首先用Target Scan鑒定miR-21-3p的潛在mRNA靶標(biāo)，并預(yù)測CTDSPL是miR-21-3p的靶基因，見圖3。為了證實CTDSPL是miR-21-3p的真正分子靶標(biāo)，在miR-21-3p mimic 或miR-21-3p inhibitor與CTDSPL WT 3'-UTR質(zhì)粒和CTDSPL Mut 3'-UTR質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染后，在A549細(xì)胞中進行熒光素酶報告分子測定。共轉(zhuǎn)染實驗顯示，miR-21-3p mimic顯著降低了A549細(xì)胞中WT型CTDSPL的熒光素酶活性（WT+miR-NC組vs WT+miR-21-3p mimic組），采用miR-21-3p inhibitor轉(zhuǎn)染則顯著增加了這種活性（WT+miR-NC組vs WT+miR-21-3p inhibitor組），通過數(shù)據(jù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；但使用Mut型CTDSPL未觀察到該結(jié)果，通過數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表2。

圖3 預(yù)測的CTDSPL的3′-UTR區(qū)與miR-21-3p的結(jié)合序列以及構(gòu)建的CTDSPL突變體

表2 各組相對熒光活性比較(?±s?)

表2 各組相對熒光活性比較(?±s?)

注：與WT+miR-NC組比，*P＜0.05。

組別 例數(shù) 相對熒光活性(%)WT+miR-NC組 3 98.89±9.25 WT+miR-21-3p mimic組 3 32.38±6.43*WT+miR-21-3p inhibitor組 3 259.62±18.74*Mut+miR-NC組 3 101.43±7.38 Mut+miR-21-3p mimic組 3 104.19±6.54 Mut+miR-21-3p inhibitor組 3 96.94±11.31 F值 245.312 P值 ＜0.05

2.5 CTDSPL蛋白表達情況Western blot法進一步研究了BEAS-2B細(xì)胞、A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-21-3p inhibitor的A549細(xì)胞中CTDSPL表達，結(jié)果顯示，與BEAS-2B細(xì)胞比，A549細(xì)胞中CTDSPL表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖4；與miR-NC組比，miR-21-3p inhibitor組CTDSPL蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖5。

表3 BEAS-2B和A549細(xì)胞中CTDSPL蛋白相對表達量比較 (?±s?)

表3 BEAS-2B和A549細(xì)胞中CTDSPL蛋白相對表達量比較 (?±s?)

注：CTDSPL：CTD小磷酸酶樣蛋白。

組別 例數(shù) 相對表達量(%)BEAS-2B細(xì)胞 3 101.43±5.21 A549細(xì)胞 3 28.69±7.43 t值 26.478 P值 ＜0.05

圖4 Western blot法檢測BEAS-2B和A549細(xì)胞中CTDSPL蛋白表達

表4 miR-NC組和miR-21-3p inhibitor組A549細(xì)胞中CTDSPL蛋白相對表達量比較(?±s?)

表4 miR-NC組和miR-21-3p inhibitor組A549細(xì)胞中CTDSPL蛋白相對表達量比較(?±s?)

組別 例數(shù) 相對表達量(%)miR-NC組 3 98.68±8.79 miR-21-3p inhibitor組 3 416.53±29.36 t值 25.412 P值 ＜0.05

圖5 Western blot法檢測miR-NC組和miR-21-3p inhibitor組CTDSPL的蛋白表達

2.6 敲低miR-21-3p表達通過CTDSPL降低A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲與miR-21-3p inhibitor+sh-Con組比較，miR-21-3p inhibitor+sh-CTDSPL組細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表5、圖6。

表5 sh-CTDSPL能部分逆轉(zhuǎn)miR-21-3p inhibitor對A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用(?±s?)

表5 sh-CTDSPL能部分逆轉(zhuǎn)miR-21-3p inhibitor對A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用(?±s?)

注：與miR-NC+sh-Con組比，#P＜0.05；與miR-21-3p inhibitor+sh-Con組比，△P＜0.05。

組別 例數(shù) 細(xì)胞活性(%) 遷移細(xì)胞數(shù)(個) 侵襲細(xì)胞數(shù)(個)miR-NC+sh-Con 組 3 102.38±10.54 236.45±29.56 124.52±18.56 miR-21-3p inhibitor+sh-Con 組 3 49.56±6.23# 83.66±24.52# 56.73±9.28#miR-21-3p inhibitor+sh-CTDSPL組 3 78.35±8.42△ 178.53±20.15△ 101.23±21.54△F值 89.692 71.034 125.395 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖6 各組代表性細(xì)胞遷移與侵襲的Transwell圖（×200）

3 討論

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，肺癌一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，研究表明，NSCLC細(xì)胞的高速增殖、遷移及侵襲水平不僅能促進NSCLC的進展，還與其預(yù)后不良密切相關(guān)[4]。盡管近幾十年來對NSCLC進展的機制已進行了大量研究且已取得了眾多成果，但目前對于NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的機制仍不完全清楚。對影響NSCLC的機制進一步研究有助于制定更優(yōu)的NSCLC治療策略。因此，探索NSCLC的進展中新的分子靶標(biāo)和作用機制，對于延長NSCLC患者的生存至關(guān)重要。

miRNAs在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲中發(fā)揮重要作用[5]。其中，miR-21-3p定位于人類染色體17q23.1上，其已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、直腸癌及口腔癌等多種惡性腫瘤患者中呈異常高表達，且可發(fā)揮促腫瘤因子作用[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p也在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞中呈高表達，提示miR-21-3p在NSCLC細(xì)胞進展中可能也發(fā)揮著重要作用。為驗證miR-21-3p在NSCLC進展中的作用，本研究進一步在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitor，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21-3p的表達可以降低A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，這一結(jié)果提示抑制miR-21-3p的表達可能是潛在的抵抗NSCLC進展的有效策略。miRNAs是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達來發(fā)揮生物學(xué)作用[9]。先前已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過靶向HBP1增強耐藥性肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[10]。而同一個miRNA可通過不同的靶基因在機體中發(fā)揮相同甚至不同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，本研究對miR-21-3p在發(fā)揮調(diào)控NSCLC中作用的靶基因進行了進一步探索，發(fā)現(xiàn)CTDSPL是miR-21-3p的靶基因，抑制miR-21-3p的表達且能上調(diào)CTDSPL的表達。已有文獻報道，CTDSPL高表達能促進肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[11]。盡管miR-21-3p具有許多其他靶向基因，但sh-CTDSPL可以成功地抵抗miR-21-3p inhibotor對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用，這些發(fā)現(xiàn)揭示了上調(diào)靶基因CTDSPL的表達是miR-21-3p作為抑制NSCLC進展中的關(guān)鍵機制。

綜上，miR-21-3p在NSCLC細(xì)胞中呈高表達，下調(diào)其表達能通過促進CTDSPL的表達來抑制NSCLC的增殖、遷移和侵襲。此外，下調(diào)CTDSPL可以部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-21-3p表達對NSCLC的增殖、遷移和侵襲的抑制作用，這些結(jié)果可能為臨床治療NSCLC提供一種新的參考方法。