抗環(huán)瓜氨酸肽抗體IgG檢測試劑(酶聯(lián)免疫吸附試驗)的臨床試驗*

王思英，楊湘越

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，福建福州 350005；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院檢驗科，福建福州 350001

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA) 是一組以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要表現(xiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病，在任何年齡均可發(fā)病，發(fā)病率隨著年齡增長呈現(xiàn)遞增趨勢。有研究顯示RA的全球發(fā)病率約為1.0%，在我國為0.32%～0.36%，致殘率高達(dá)15%[1-2]，RA患者與相同年齡、性別的健康人比較總死亡率增加[3]。國外較多研究證實，通過對RA患者血清抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體的檢測，能夠?qū)A患者進(jìn)行早期病情診斷和預(yù)測，對治療和預(yù)后監(jiān)測均具有重要意義[4]。絲集蛋白中的稀有氨基酸瓜氨酸是抗CCP抗體主要的抗原表位，通過比較研究發(fā)現(xiàn)，用環(huán)化的瓜氨酸肽代替線性的瓜氨酸肽作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的抗原基質(zhì)，可將靈敏度從49%提高到68%，抗CCP抗體是RA的一個高度特異的新指標(biāo)[5-8]?？笴CP抗體的出現(xiàn)獨立于類風(fēng)濕因子(RF)。彭吉芳[9]的研究表明，RF不僅存在于RA患者中，在其他疾病(如干燥綜合征、麻風(fēng)、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎等)中也被檢出，甚至在健康人中也被檢出。把RF陰性的患者稱為“血清反應(yīng)陰性的RA”的說法已經(jīng)過時了，不應(yīng)再使用。許多研究顯示，20%～57% RF陰性的RA患者血清中存在抗CCP抗體。因此，平行檢測這兩種抗體有利于提高RA患者的血清學(xué)檢出率[10-14]。目前批準(zhǔn)上市的抗 CCP 抗體檢測試劑很多，并且在臨床得到了廣泛使用，但大部分基層醫(yī)院因成本等原因沒有開展抗 CCP 抗體檢測。為推廣國產(chǎn)抗 CCP 抗體IgG檢測試劑(ELISA)的應(yīng)用，本研究以上海榮盛生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的抗CCP抗體檢測試劑(ELISA，滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2401823號)為對照試劑，以歐蒙(德國)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司生產(chǎn)的抗CCP抗體IgG檢測試劑(ELISA，國械注進(jìn)20162400106)為第三方試劑，對歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司作為申請人申請的抗CCP抗體IgG檢測試劑(ELISA，擬注冊)進(jìn)行臨床驗證，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本來自2019年1—9月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院常規(guī)檢測的剩余標(biāo)本，在≤-20 ℃的低溫條件下長期保存，所有標(biāo)本的相關(guān)信息完整，試劑為歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司作為申請人申請的抗CCP抗體IgG檢測試劑(ELISA，擬注冊)。根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，本試驗所評價試劑屬于二類體外診斷試劑，臨床試驗的總血清標(biāo)本數(shù)至少為200例，同源血漿標(biāo)本100例，分兩家醫(yī)院完成，中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院負(fù)責(zé)其中的116例有效血清標(biāo)本及53例有效同源血漿標(biāo)本。標(biāo)本分為疾病組(來自臨床懷疑為抗CCP抗體陽性的患者)血清67例、血漿15例，易混組(來自已明確為其他疾病且未送檢抗CCP抗體的患者)血清19例、血漿8例，對照組(健康人群)血清30例、血漿30例。本試驗經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○○醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 待評價試劑用于體外半定量或定量檢測人血清或血漿中抗CCP IgG型抗體，適應(yīng)證為RA。本試驗采用對照試驗和雙盲法設(shè)計，將同一標(biāo)本用待評價試劑、對照試劑及第三方分別進(jìn)行檢測。將待評價試劑檢測結(jié)果與對照試劑及第三方試劑檢測結(jié)果進(jìn)行比較，評價待評價試劑與對照試劑及第三方試劑試劑檢測結(jié)果的一致性和相關(guān)性。采用待評價試劑對同一人的血清和血漿標(biāo)本分別進(jìn)行檢測，判斷待評價試劑對血清和血漿標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性和相關(guān)性。試劑中每個微孔板條含有8個可拆分的包被有合成CCP的微孔。在第1次溫育時，稀釋后的標(biāo)本(血清或肝素、EDTA、檸檬酸抗凝的血漿)在微孔中反應(yīng)。如果標(biāo)本陽性，特異性的IgG(包括IgA和IgM)與抗原結(jié)合，為了檢測結(jié)合的抗體，加入酶標(biāo)抗人IgG抗體(酶結(jié)合物)進(jìn)行第2次溫育，以發(fā)生顏色反應(yīng)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 兩種診斷試驗的一致性比較采用定性檢測，以符合率和Kappa值進(jìn)行評價。Kappa值:≥0.75為一致性好；0.40～<0.75為一致性一般； <0.40為一致性較差。相關(guān)性分析采用回歸分析，將待評價試劑檢測結(jié)果(Y)分別和對應(yīng)的對照試劑及第三方試劑檢測結(jié)果(X)作回歸分析布圖，建立回歸方程Y=a+bX并分析。R>0.9時,所得到的回歸直線擬合得較好；R<0.5時，所得到的回歸直線很難說明變量之間的依賴關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1待評價試劑與對照試劑一致性及相關(guān)性分析

2.1.1待評價試劑與對照試劑一致性分析 一致性分析結(jié)果顯示，陽性符合率為70.00%(21/30×100%)，陰性符合率為95.35%(82/86×100%)，總符合率為88.79%(103/116×100%)，kappa值為0.69。見表1。

表1 待評價試劑與對照試劑一致性分析結(jié)果(n)

2.1.2待評價試劑與對照試劑相關(guān)性分析 最終共有20份標(biāo)本的檢測結(jié)果在待評價試劑與對照試劑檢測范圍內(nèi)，對這20份血清標(biāo)本的結(jié)果進(jìn)行了回歸分析，回歸方程：Y=1.629X+0.968 9，R=0.51。見圖1。

圖1 待評價試劑與對照試劑相關(guān)性回歸分析圖

2.2待評價試劑與第三方試劑一致性及相關(guān)性分析

2.2.1待評價試劑與第三方試劑一致性分析 一致性分析結(jié)果顯示，陽性符合率為73.53%(25/34×100%)，陰性符合率為100.00%(82/82×100%)，總符合率為92.24%(107/116×100%)，kappa值為0.80。見表2。

表2 待評價試劑與第三方試劑一致性分析結(jié)果(n)

2.2.2待評價試劑與第三方試劑相關(guān)性分析 最終共有26份標(biāo)本的檢測結(jié)果在待評價試劑與第三方試劑檢測范圍內(nèi)，對于這26份血清標(biāo)本的結(jié)果進(jìn)行了回歸分析，回歸方程：Y=0.948 5X-4.640 2，R=0.97。見圖2。

圖2 待評價試劑與第三方試劑回歸分析圖

2.3待評價試劑與對照試劑/第三方試劑檢測結(jié)果綜合比較 待評價試劑與對照試劑的檢測結(jié)果不符的情況下，采用第三方試劑的結(jié)果為準(zhǔn)，再次進(jìn)行了所有結(jié)果的綜合，與待評價試劑進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，陽性符合率為89.29%(25/28×100%)，陰性符合率為100.00%(88/88×100%)，總符合率為97.41%(113/116×100%)，kappa值為0.93。見表3。

表3 待評價試劑與對照試劑和第三方試劑檢測結(jié)果綜合比較(n)

2.4待評價試劑血清與同源血漿標(biāo)本檢測結(jié)果一致性及相關(guān)性分析

2.4.1待評價試劑血清與同源血漿標(biāo)本檢測結(jié)果一致性分析 總共53份與血清標(biāo)本同源的血漿標(biāo)本采用待評價試劑進(jìn)行了檢測，一致性分析結(jié)果顯示，陽性符合率為81.82%(9/11×100%)，陰性符合率為95.24%(40/42×100%)，總符合率為92.45%(49/53×100%)，Kappa值=0.77。見表4。

表4 待評價試劑血清與同源血漿標(biāo)本檢測結(jié)果比較(n)

2.4.2待評價試劑血清與同源血漿標(biāo)本檢測結(jié)果相關(guān)性分析 對同源血清與同源血漿的定量檢測結(jié)果進(jìn)行了分析，最終共有10份標(biāo)本的檢測結(jié)果在待評價試劑與第三方試劑檢測范圍內(nèi)，對于這10份血清和血漿標(biāo)本的結(jié)果進(jìn)行了回歸分析，回歸方程：Y= 0.835X+15.886,R=0.92。見圖3。

圖3 待評價試劑血清與同源血漿標(biāo)本檢測結(jié)果回歸分析圖

3 討 論

RA是一類病因未明、以慢性持續(xù)性關(guān)節(jié)破壞為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)受累為其主要而非唯一的臨床表現(xiàn)[15]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，抗CCP 抗體陽性的RA 患者更易出現(xiàn)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)破壞，且抗CCP 抗體滴度與RA 的病情活動度相關(guān)，因而也可作為評判病情及預(yù)后的重要指標(biāo)[16-17]。有研究顯示[18-19]，女性發(fā)病率為男性的2～3倍，在GADEHOLT等[20]的研究結(jié)果中，抗CCP抗體陽性患者的病程較抗CCP抗體陰性患者長，可能與抗CCP抗體陽性患者的發(fā)病更早相關(guān)。因此為使疾病能夠得到盡早發(fā)現(xiàn)、盡早治療，早期篩查顯得格外重要。抗CCP抗體檢測試劑大量應(yīng)用于RA患者、健康者，此外，基層醫(yī)院的篩查費用較昂貴(尤其使用進(jìn)口試劑時)，因此推廣國產(chǎn)試劑有利于降低成本費用，這也是本臨床試驗的意義所在。

待評價試劑用于體外半定量或定量檢測人血清或血漿中抗CCP IgG型抗體。本臨床試驗采用了待評價試劑與對照試劑/第三方試劑比較的方法確認(rèn)了待評價試劑的性能,同時本臨床試驗增加了待評價試劑與第三方試劑的性能對比作為性能評價的補充評價標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到目前市場上占有率最高的同類產(chǎn)品為歐蒙(德國)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司生產(chǎn)的抗CCP抗體IgG測定試劑(ELISA)，有必要將待評價試劑的性能與目前最廣泛使用的產(chǎn)品進(jìn)行性能比較，因此本臨床試驗選擇歐蒙(德國)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品作為第三方試劑，并且采用第三方試劑對所有待檢測標(biāo)本進(jìn)行檢測。在116例有效檢測血清標(biāo)本中，待評價試劑與對照試劑間共出現(xiàn)13例不一致結(jié)果，經(jīng)過第三方試劑檢測，待評價試劑與對照試劑/第三方試劑間共出現(xiàn)3例不一致結(jié)果。這3例血清標(biāo)本采用待評價試劑與第三方試劑檢測，結(jié)果均在臨界值左右，第三方試劑檢測結(jié)果為弱陽性而待評價試劑檢測結(jié)果為陰性。因此該3例標(biāo)本的檢測結(jié)果不能說明待評價試劑與第三方試劑檢測性能存在重大差異。

本臨床試驗單位共檢測有效血清標(biāo)本116例，有效同源血漿標(biāo)本53例。待評價試劑與對照試劑的血清檢測結(jié)果陽性符合率為70.00%，陰性符合率為95.35%，總符合率為88.79%，kappa值為0.69。針對定量結(jié)果進(jìn)行分析，回歸方程：Y=1.629X+0.968 9，R=0.51。表明待評價試劑與對照試劑血清標(biāo)本檢測結(jié)果一致性良好，但是相關(guān)性不佳。待評價試劑與第三方試劑的血清檢測結(jié)果陽性符合率為73.53%，陰性符合率為100.00%，總符合率為92.24%，kappa值為0.80。針對定量結(jié)果進(jìn)行分析，回歸方程：Y=0.948 5X-4.640 2，R=0.97，表明待評價試劑與對照試劑血清標(biāo)本檢測結(jié)果一致性和相關(guān)性良好。待評價試劑與對照試劑檢測不相符的標(biāo)本，以第三方試劑的而檢測結(jié)果為準(zhǔn)，最終待評價試劑與對照試劑/第三方試劑的血清檢測陽性符合率為89.29%，陰性符合率為100.00%，總符合率為97.41%，kappa值為0.93。表明待評價試劑與對照試劑/第三方試劑血清檢測結(jié)果一致性良好。待評價試劑檢測血清與同源血漿標(biāo)本陽性符合率為81.82%，陰性符合率為95.24%，總符合率為92.45%，kappa值為0.77。針對定量結(jié)果進(jìn)行分析，回歸方程：Y=0.835X+15.886，R=0.92。表明待評價試劑檢測血清與同源血漿標(biāo)本的符合性和相關(guān)性良好。

綜上所述，本試驗中的待評價試劑與對照試劑/第三方試劑的檢測結(jié)果有良好的一致性和相關(guān)性，待評價試劑檢測血清與同源血漿標(biāo)本的一致性及相關(guān)性均良好，提示有較好的臨床適用性。