先天性心臟病胎兒的染色體微陣列分析*

鐘艷娟，盧 建，吳佳佳，吳澤珊，陳劍虹

1.廣東省惠州市第一婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東惠州 516001；2.廣東省婦幼保健院胎兒遺傳醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510000

先天性心臟病(CHD)是胎兒時(shí)期心血管發(fā)育異常而形成的先天畸形，是導(dǎo)致新生兒及嬰幼兒死亡的主要原因之一。全世界每年大約有135萬例先天性心臟病患兒出生[1]，而我國(guó)新生兒先天性心臟病發(fā)病率為 7‰～8‰[2]，連續(xù)多年位居出生缺陷第一位。研究表明，產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)的CHD胎兒中，18%～22%合并染色體異?；蛑虏⌒匀旧w拷貝數(shù)變異(CNV)[3]。因此，避免合并染色體異常以及致病性CNV的CHD患兒出生，成為降低出生缺陷的一項(xiàng)重要舉措。目前，染色體核型分析仍是產(chǎn)前診斷的主要檢測(cè)方法，但是無法檢測(cè)到5 Mb以下染色體片段的重復(fù)和缺失。染色體微陣列分析(CMA)是近年發(fā)展起來的高分辨率分子技術(shù)，能在全基因組水平進(jìn)行掃描，對(duì)于染色體微缺失、微重復(fù)等不平衡重排有明顯優(yōu)勢(shì)。根據(jù)芯片設(shè)計(jì)與檢測(cè)原理的不同，CMA技術(shù)可分為兩大類：基于微陣列的比較基因組雜交(aCGH)技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP array)技術(shù)。通過aCGH技術(shù)能夠很好地檢出CNV，而SNP array 技術(shù)除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測(cè)出大多數(shù)的單親二倍體(UPD)和三倍體，并且可以檢測(cè)到一定水平的嵌合體。而設(shè)計(jì)涵蓋aCGH+SNP array檢測(cè)探針的芯片，可同時(shí)具有aCGH和SNP array芯片的特點(diǎn)[4-5]。2013年，美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)(ACOG)及美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(SMFM)發(fā)表臨床指南，指出在產(chǎn)前超聲檢查顯示結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，推薦用CMA替代傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)[6]。本研究通過應(yīng)用CMA，在全基因組水平分析CHD胎兒的遺傳學(xué)病因，探索CMA技術(shù)在CHD胎兒致病基因中的臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年5月至2020年5月于廣東省惠州市第一婦幼保健院超聲科經(jīng)2位有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的超聲專家確診胎兒為CHD的病例，由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)及具備相應(yīng)資質(zhì)的臨床遺傳醫(yī)師對(duì)孕婦及家屬進(jìn)行遺傳咨詢，充分告知介入性產(chǎn)前診斷手術(shù)的感染風(fēng)險(xiǎn)、胎兒丟失率，詳細(xì)講解CMA技術(shù)以及染色體核型分析的優(yōu)勢(shì)、局限性和可能的結(jié)果等，孕婦及其家屬自愿選擇進(jìn)行產(chǎn)前診斷，并簽署手術(shù)知情同意書。納入研究的孕婦共216例，其中檢測(cè)羊水標(biāo)本211例，臍血標(biāo)本5例，均同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析及CMA，本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2方法

1.2.1分組 在216例CHD胎兒中，根據(jù)結(jié)構(gòu)畸形情況分成3組：?jiǎn)我恍呐K結(jié)構(gòu)畸形組(Ⅰ組)、多發(fā)心臟結(jié)構(gòu)畸形組(Ⅱ組)、心內(nèi)合并心外結(jié)構(gòu)畸形組(Ⅲ組)。Ⅰ組胎兒只有1處心血管畸形，Ⅱ組胎兒具有2處及以上心血管畸形，Ⅲ組胎兒心內(nèi)合并心外結(jié)構(gòu)異常，包括神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(FGR)、羊水過多、羊水過少等。

1.2.2染色體核型分析 在無菌操作條件下，將抽取的羊水或臍血裝入無菌離心管內(nèi)離心收集羊水或臍血細(xì)胞，采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)，收獲、制片和G顯帶，全自動(dòng)掃描儀掃描、拍照。依據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2009)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行G顯帶染色體核型分析診斷。

1.2.3CMA檢測(cè) 收集的胎兒羊水或臍血標(biāo)本及時(shí)送至廣東省婦幼保健院胎兒遺傳醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行檢測(cè)。該中心使用美國(guó)Afffymetrix公司生產(chǎn)的Cytoscan 750k芯片對(duì)全基因組已知基因區(qū)域進(jìn)行掃描，數(shù)據(jù)分析參照DECIPHER、ISCA、OMIM、DGV、UCSC等數(shù)據(jù)庫(kù)資料。判斷所檢出CNV的性質(zhì)，根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分為：(1)致病性CNV；(2)臨床意義不明確的CNV(VOUS )；(3)良性CNV。

1.2.4CMA結(jié)果驗(yàn)證 對(duì)CMA檢出為致病性CNV的胎兒標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果提示VOUS時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)胎兒父母的CNV，排除家族性良性變異，給予家屬客觀的遺傳咨詢意見。

1.3隨訪 對(duì)所有CHD胎兒病例進(jìn)行電話隨訪，分娩新生兒隨訪至1歲，記錄妊娠結(jié)局、產(chǎn)后超聲復(fù)查情況、出生后手術(shù)治療效果以及生長(zhǎng)發(fā)育情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基本信息 納入研究的216例CHD胎兒中，Ⅰ組91例，占42.13%；Ⅱ組66例，占30.56%；Ⅲ組59例，占27.31%。孕婦年齡19～41歲、中位年齡27歲，孕周18～30周、中位孕周為26周。夫妻雙方無明顯遺傳病家族史，孕婦不合并嚴(yán)重內(nèi)外科疾病。

2.2染色體核型分析結(jié)果 216例CHD胎兒中，檢測(cè)出19例染色體異常，檢出率為8.80%，其中，Ⅰ組檢測(cè)出6例 (6.59%)，Ⅱ組檢測(cè)出6例 (9.09%)，Ⅲ組檢測(cè)出7例(11.86%)，3組異常檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。19例染色體異常包括：4例21-三體綜合征；4例18-三體綜合征；2例13-三體綜合征；1例45，X；1例47，XXY；4例染色體缺失，分別是46,XN,del(13)(p11.1)、46,XN，del(3)(q24q25)、46，XX，del(X)(q26.3-q28)、46,XN,del(10)(q26.3)；1例染色體重復(fù)，46，XN，dup(6)(q23.3-q25.3)；1例染色體平衡易位46，XN，t(3；7)(p34;q12)mat，1例5號(hào)染色體倒位，46,XN,inv(5)(p15.3q13)mat。其余197例染色體正常，其中包括6例染色體多態(tài)性；2例46，XN，inv(9)；1例46，X，inv(Y)；2例46，XN，1qh+；1例46，XN，16qh+，均對(duì)父母進(jìn)行外周血染色體核型分析，判斷來源于正常表型的父母其中一方，歸入正常染色體。

2.3CMA檢測(cè)結(jié)果 216例CHD胎兒標(biāo)本均進(jìn)行CMA檢測(cè)，共檢測(cè)出31例致病性CNV，檢出率為14.35%，在19例染色體核型分析異常病例中，12例為染色體非整倍體，4例染色體缺失，1例染色體重復(fù)，CMA檢測(cè)出相同結(jié)果；1例染色體平衡易位及1例染色體5號(hào)倒位，CMA未檢測(cè)出異常。3組胎兒CMA檢測(cè)提示致病性CNV檢出率分別為：Ⅰ組檢測(cè)出8例(8.79%)，Ⅱ組檢測(cè)出9例(13.64%)，Ⅲ組檢測(cè)出14例(23.73%)，3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2；在197例染色體正常的CHD胎兒中，CMA額外檢測(cè)到14例異常，將CHD胎兒的遺傳學(xué)病因檢出率提高了7.11%。此外，CMA再檢測(cè)出13例VOUS，VOUS檢出率為6.02%(13/216)，進(jìn)一步對(duì)父母外周血進(jìn)行CMA檢測(cè)，提示其中9例來源于正常表型父母其中一方，最終判斷為家族性變異，歸為良性CNV，4例為新發(fā)變異，分別是：1例在5號(hào)染色體5q11.2位置發(fā)生重復(fù)，片段大小約2.0 Mb；1例在16號(hào)染色體16q23.3-q24.1位置發(fā)生缺失，片段大小約647 kb；1例在染色體11q13.2-q13.3位置發(fā)生缺失，片段大小1.6 Mb；1例在4號(hào)染色體4q27位置發(fā)生缺失，片段大小約547 Kb，這些CNV臨床意義目前無法明確。

2.4隨訪 對(duì)216例CHD胎兒的妊娠結(jié)局及產(chǎn)后生長(zhǎng)發(fā)育情況進(jìn)行隨訪，128例分娩(59.26%)，86例終止妊娠(39.81%)，失訪2例(0.93%)。CMA檢測(cè)提示31例致病性CNV，全部終止妊娠，其中包括12例染色體非整倍體。4例新發(fā)的VOUS中，1例胎兒為單純室間隔缺損，1例胎兒為右位主動(dòng)脈弓，孕婦選擇保留胎兒，追蹤至出生后1歲，目前生長(zhǎng)發(fā)育正常；另外1例為法洛四聯(lián)癥、1例左心發(fā)育不良，孕婦選擇終止妊娠。見表2。

表1 CHD胎兒染色體核型分析及CMA檢測(cè)情況比較[n(%)]

表2 CHD胎兒CMA檢測(cè)致病性CNV的相關(guān)情況及隨訪結(jié)果

3 討 論

本研究216例CHD胎兒中，檢測(cè)出19例染色體異常，檢出率為8.80%，同時(shí)進(jìn)行CMA檢測(cè)，共檢測(cè)出31例致病性CNV，檢出率為14.35%，在197例染色體正常的CHD胎兒中，CMA額外檢測(cè)到14例異常，將CHD胎兒的遺傳學(xué)病因檢出率提高了7.11%，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道基本相符。一項(xiàng)國(guó)內(nèi)研究報(bào)道，在CHD胎兒中染色體異常的檢出率為10.2%(18/176)，對(duì)88例染色體核型分析結(jié)果正常的CHD胎兒進(jìn)行CMA檢測(cè)，致病性CNV檢出率額外增加到16%(14/88)[7]，國(guó)外多項(xiàng)研究表明，在患有CHD的新生兒中，應(yīng)用CMA技術(shù)可于10%左右的患兒中檢出致病性CNV[8-9]，另一項(xiàng)回顧性分析顯示，580例染色體核型分析結(jié)果正常的CHD患兒應(yīng)用aCGH 技術(shù)檢測(cè)，顯示致病性CNV的檢出率為7.9%[10]。因此，CHD胎兒的遺傳學(xué)病因，除了與染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的異常相關(guān)，還包括染色體微缺失、微重復(fù)，而傳統(tǒng)的染色體核型分析只能檢出大于10 Mb的大片段缺失及重復(fù)，增加CMA檢測(cè)可以明顯提高CHD胎兒遺傳學(xué)病因的檢出率。

在216例CHD胎兒中，根據(jù)結(jié)構(gòu)畸形情況分成3組：?jiǎn)我恍呐K結(jié)構(gòu)畸形組、多發(fā)心臟結(jié)構(gòu)畸形組、心內(nèi)合并心外結(jié)構(gòu)畸形組，這3組病例的染色體異常檢出率與CMA提示致病性CNV的檢出率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道相符[11-12]。因此，無論是單一的心臟結(jié)構(gòu)畸形，還是多發(fā)心臟結(jié)構(gòu)畸形，無論是否合并心外畸形，均與染色體異常相關(guān)，針對(duì)所有心臟結(jié)構(gòu)畸形的胎兒，均應(yīng)告知孕婦及家屬胎兒染色體異常風(fēng)險(xiǎn)，并且建議行介入性產(chǎn)前診斷，為評(píng)估CHD胎兒的遠(yuǎn)期預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

本研究在216例CHD胎兒中，發(fā)現(xiàn)4例22q11.2微缺失綜合征，異常診斷率為1.85%，據(jù)國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究報(bào)道，在204例心血管異常的產(chǎn)前標(biāo)本中，檢出6例22q11.2微缺失綜合征，診斷率為2.94%[13]。該區(qū)域缺失可導(dǎo)致心臟畸形、異常面部形態(tài)、胸腺發(fā)育不全、腭裂和低血鈣等臨床表現(xiàn)，也稱為DiGeorge綜合征,發(fā)病率為1/4 000[14-15]。該遺傳綜合征患兒預(yù)后不良，無法根治，因此，CMA技術(shù)從出生后患兒的檢測(cè)走向胎兒的產(chǎn)前診斷，其臨床應(yīng)用價(jià)值更高。

由于CMA技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地確定胎兒染色體異常的位置及片段大小，分辨率高，檢測(cè)效率快，目前多項(xiàng)研究推薦將CMA技術(shù)作為產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒遺傳學(xué)病因的一線檢測(cè)方法[16-17]。但是，由于CNV在人類基因組中的分布非常廣泛，約占基因組序列的12%[18]，導(dǎo)致臨床在應(yīng)用CMA技術(shù)的過程中，對(duì)CNV的判斷和臨床意義的解釋面臨許多困難。在產(chǎn)前診斷中使用CMA檢測(cè)，經(jīng)常出現(xiàn)無法判讀和解釋的VOUS。一項(xiàng)對(duì)143例室間隔缺損胎兒標(biāo)本的研究中，CMA檢測(cè)出17例VOUS(11.9%)，通過進(jìn)一步對(duì)父母進(jìn)行CMA檢測(cè)，顯示12例遺傳自正常表型父母，為良性CNV,但仍有5例(3.5%)為新發(fā)，無法判讀臨床意義[19]。本研究中，VOUS檢出率為6.02%(13/216)，進(jìn)一步對(duì)父母外周血進(jìn)行CMA檢測(cè)，提示其中9例來源于正常表型父母其中一方，最終判斷為家族性變異，歸為良性CNV，4例為新發(fā)變異。因此，即使對(duì)父母進(jìn)行CMA檢測(cè)，仍然無法對(duì)所有VOUS的臨床性質(zhì)做出確切的判斷，應(yīng)根據(jù)胎兒的超聲表現(xiàn)，謹(jǐn)慎考慮胎兒去留，避免不必要的終止妊娠。

任何檢驗(yàn)技術(shù)均有其自身的局限性，CMA無法檢出平衡性染色體重排，如平衡易位、倒位和大多數(shù)基因位內(nèi)點(diǎn)突變[20]。本研究中，有1例染色體平衡易位及1例染色體5號(hào)倒位，CMA未檢測(cè)出異常。

綜上所述，CMA技術(shù)在CHD胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，可增加遺傳學(xué)病因的檢出率，在臨床應(yīng)用中，應(yīng)結(jié)合超聲表現(xiàn)及染色體核型分析結(jié)果，做出全面的結(jié)果判讀和解釋。本研究的不足之處在于部分復(fù)雜性心臟畸形以及合并多系統(tǒng)畸形的病例拒絕進(jìn)行產(chǎn)前診斷，而選擇直接終止妊娠，導(dǎo)致病例結(jié)構(gòu)的偏倚，未來需進(jìn)一步收集多中心病例，可以做出更客觀的數(shù)據(jù)分析。