裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯酸解工藝優(yōu)化及降解產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎活性

李曉旭，劉舒，洪濱，劉文博，任丹丹，汪秋寬，何云海*，洪瑞晨，付開艷，宋悅凡

(1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,國(guó)家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023;2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連 116034;3.大連海關(guān)技術(shù)中心,遼寧 大連 116014)

裙帶菜UndariapinnatifidaSuringar屬褐藻門Phaeophyta褐藻綱Phaeophyceae海帶目Laminariales翅藻科Pteridophytae裙帶菜屬Undaria[1]，俗稱海芥菜、裙帶，素有健康菜、綠色海參之美稱，主要分布于遼寧沿海和山東部分地區(qū)。裙帶菜具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，同時(shí)還含有褐藻酸、甘露醇、褐藻糖膠、高不飽和脂肪酸、巖藻黃素等多種具有獨(dú)特生理功能的活性成分[2]。裙帶菜尤其是孢子葉富含巖藻聚糖硫酸酯，巖藻聚糖硫酸酯也稱褐藻糖膠、巖藻多糖，是褐藻和某些棘皮動(dòng)物中特有的一種含有硫酸基的天然活性多糖。巖藻聚糖硫酸酯具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、增加腸道益生菌[3]、降血脂[4]、抗血管生成[5]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[6]等多重生物活性。近年來，巖藻聚糖硫酸酯的抗炎活性已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，但是巖藻聚糖硫酸酯分子量大不利于生物體吸收，難以進(jìn)行消化[7]，且從不同藻類中提取的多糖，其化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)也不同，由于其復(fù)雜性，在一定程度上削弱了其所具有的生物活性，也限制了巖藻聚糖硫酸酯在各領(lǐng)域中的應(yīng)用[8]，因此，對(duì)更易吸收且結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的巖藻寡糖的相關(guān)研究便逐漸興起。

巖藻寡糖是將巖藻聚糖硫酸酯通過降解得到的一種低分子聚合物，巖藻寡糖分子量小、溶解性強(qiáng)、能夠較好地被生物體吸收，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒等生物活性[9]。但目前巖藻寡糖的制備工藝和開發(fā)利用程度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。常用的巖藻寡糖制備方法有物理降解法、生物降解法和化學(xué)降解法。其中，物理降解法操作方便簡(jiǎn)單、無(wú)污染，是一種綠色的制備方法，但該方法制備產(chǎn)率較低且降解效果較差；生物降解法具有綠色環(huán)保、產(chǎn)率高、均一性好、反應(yīng)溫和等優(yōu)勢(shì)，但目前制備寡糖的優(yōu)勢(shì)酶篩選困難且酶解條件仍未確定；化學(xué)降解法在巖藻聚糖硫酸酯的降解中引入最早，應(yīng)用較為普遍，但反應(yīng)較為劇烈易造成降解不穩(wěn)定或硫酸基的斷裂等問題，所以需對(duì)降解條件進(jìn)行細(xì)致優(yōu)化。

為了有效降解裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯，并探究其降解產(chǎn)物的抗炎活性，本研究中通過酸解法降解裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯得到包含巖藻寡糖的降解產(chǎn)物，利用薄層色譜法測(cè)定其聚合度并確定其最佳降解條件，利用膜分離技術(shù)獲得不同分子量的降解產(chǎn)物，測(cè)定各組分的總糖含量及硫酸基團(tuán)含量，并分析酸解裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的影響，以期為裙帶菜巖藻寡糖的制備及應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan,F)來自國(guó)家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心(大連)。

試劑：寡糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司，ELISA試劑盒、CCK-8試劑、無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、DMEM培養(yǎng)基、脂多糖、胎牛血清等均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要儀器設(shè)備：101-2-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、FD-4冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、CL-1A磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)、25 μL微量進(jìn)樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)、354酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)、721型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、371 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific LLC)、Sartorius普及型pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 酸解裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯工藝優(yōu)化 采用酸解法，將裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯(利用復(fù)合酶酶解-熱水浸提法[10]提取)溶于稀鹽酸中，分別在不同溫度條件下酸解后取出并冷卻至室溫，用氫氧化鈉調(diào)至中性后放入冰箱中冷凍后再放入凍干機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉。

酸解溫度設(shè)置為90、95、100、105、110 ℃，時(shí)間設(shè)置為2、3、4 h，酸解液pH設(shè)置為2、3、4。先采用全因子試驗(yàn)，再采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酸解法降解裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯的工藝。

1.2.2 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯降解產(chǎn)物檢測(cè) 采用薄層色譜法(TLC)[11]，分別稱取0.01 g寡糖標(biāo)準(zhǔn)品和巖藻聚糖硫酸酯降解產(chǎn)物混合樣品溶于1 mL去離子水中，在100 ℃活化30 min后的硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5 μL，用展開劑(甲醇、正丁醇、水三者的體積比為6∶4∶1)進(jìn)行展開，用顯色劑(苯胺-二苯胺)進(jìn)行顯色，置于105 ℃烘箱烘烤5～6 min，觀察顯色情況。

1.2.3 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯降解產(chǎn)物的分離 采用膜分離法[12]，將酸解制得的裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯降解產(chǎn)物混合液由大到小依次通過不同膜通量的膜組件分離，分別得到相對(duì)分子質(zhì)量范圍為400～1 000 (F1)、1 000～3 500 (F2)、3 500～5 000 (F3)、5 000～10 000 (F4)及10 000 以上(F5)5個(gè)組別的降解產(chǎn)物，其中F1、F2為巖藻寡糖。

1.2.4 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物純度測(cè)定

總糖含量：取F及F1～F5樣品配制成0.05 mg/mL的溶液，采用苯酚-硫酸法[13]進(jìn)行測(cè)定。硫酸基團(tuán)含量：取0.1 g F及F1～F5樣品加入10 mL 2 mol/L的HCl，采用氯化鋇明膠法[14]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞抗炎活性的影響

1)對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。采用CCK-8法[15]，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定含F(xiàn)及F1～F5樣品的試驗(yàn)組、不含樣品的調(diào)零組及不含細(xì)胞與樣品的空白組的吸光度值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為

細(xì)胞存活率=[(試驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(調(diào)零組OD值-空白組OD值)]×100%。

通過上述公式計(jì)算出各分子量樣品組的細(xì)胞存活率，從而反映巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響。

2)對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響。NO不僅是一種調(diào)節(jié)炎癥的介質(zhì)，還是一種氣體信號(hào)分子[16]。采用Griess法[17]，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定F及F1～F5樣品組、空白組及陰性對(duì)照組的吸光度值，繪制NO標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過NO反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品組的NO濃度，從而反映RAW264.7細(xì)胞釋放NO的能力大小。

3)對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子1L-1β、1L-6、1L-10和TNF-α的影響。采用ELISA法[18-19]，于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各樣品組、空白組及陰性對(duì)照組的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示(n=3)，采用SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯酸解程度的檢測(cè)

利用薄層色譜法對(duì)不同酸解條件下得到的降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。從圖1可見：90、95、100、105、110 ℃降解溫度下，樣品在pH為2時(shí)有明顯的條帶出現(xiàn)，降解效果較好，說明pH對(duì)巖藻聚糖硫酸酯降解有影響，酸解液pH值小的降解效果較好；時(shí)間與溫度因素對(duì)降解的影響不大，但降解溫度為110 ℃，pH為3、4，水解時(shí)間為3、4 h時(shí)的4個(gè)組經(jīng)過高溫長(zhǎng)時(shí)間的處理能改善降解效果。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，pH為2，水解時(shí)間為4 h，降解溫度為90、95 ℃時(shí)的2個(gè)試驗(yàn)組得到的樣品中寡糖含量較高，其次是降解溫度為90～110 ℃，酸解液pH為2，水解時(shí)間為2、3、4 h的13個(gè)試驗(yàn)組，以及降解溫度為110 ℃，pH為3、4，水解時(shí)間為3、4 h的4個(gè)試驗(yàn)組得到的樣品中寡糖含量較低，剩余26組試驗(yàn)得到的樣品中寡糖含量非常低(圖1)。綜上所述，降解溫度為90、95 ℃，pH為2，水解4 h為降解制備優(yōu)化條件，對(duì)于最優(yōu)工藝的確定還需要進(jìn)一步研究。

從圖2可見，樣品在pH為2的條件下分別在90、95 ℃下降解4 h后，A、B兩組譜帶趨勢(shì)均有較好的穩(wěn)定性，但B組條件下降解產(chǎn)物中的寡糖分子量更小。可以看出，在酸解液酸性較弱的條件下，在一定范圍內(nèi)升高降解溫度可以提高降解巖藻聚糖硫酸酯的降解效果。由此得出，裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯最優(yōu)酸解條件為95 ℃、pH 2、處理4 h。

圖2 90、95 ℃酸解溫度條件下的降解產(chǎn)物薄層層析圖譜(pH 2,處理4 h)Fig.2 Thin-layer chromatograms of degradation products under 90 and 95 ℃ acidolysis temperatures(pH 2 for 4 h)

DP代表聚合度,單糖代表聚合度分別為3、5、7的寡糖，雙糖代表聚合度分別為2、4、6的寡糖，混糖代表聚合度分別為2～7的寡糖。DP stands for degree of polymerization,monosaccharides are the oligosaccharides with polymerization degrees of 3,5 and 7,respectively,disaccharides are the oligosaccharides with polymerization degrees of 2,4 and 6,respectively,and mixed sugars are the oligosaccharides with polymerization degrees of 2-7，respectively.圖1 全因子試驗(yàn)優(yōu)化酸解工藝條件的降解產(chǎn)物薄層層析圖譜Fig.1 Thin layer chromatogram of degradation products under optimization acid hydrolysis process conditions by full factor test

2.2 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯及其降解產(chǎn)物成分

將酸解制得的裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯降解產(chǎn)物混合液依次通過截留相對(duì)分子量為10 000、5 000、3 500、1 000、400的膜組件進(jìn)行分離，分別得到不同分子量段的5個(gè)組分，將5個(gè)不同分子量段的F1～F5組分凍干，并計(jì)算得率，再利用苯酚-硫酸法和氯化鋇明膠法分別測(cè)定F及F1～F5組分的總糖含量和硫酸基團(tuán)含量。從表1可見，裙帶菜巖藻寡糖的總回收率為13.53%(F1與F2之和)。郭娟娟[20]利用酶法制備к-卡拉膠寡糖，以4 mL/min流速,1.0 g/mL上樣濃度，1 mL進(jìn)樣體積,流動(dòng)相為0.1 mol/L碳酸氫銨為最佳分離純化參數(shù)，純品得率為5.02%。經(jīng)對(duì)比，此方法的寡糖純度及得率比本試驗(yàn)中的低，由此可見，優(yōu)化酸解工藝制備裙帶菜巖藻寡糖效果較好，寡糖的損失率低且有效保留了硫酸基團(tuán)。

表1 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物成分Tab.1 Composition of fucoidan sulfate and oligosaccharide of sea mustard Undaria pinnatifid %

2.3 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎活性

2.3.1 F及F1～F5組分對(duì)RAW264.7體外增殖活性的影響 從圖3可見，不同質(zhì)量濃度的F及F1～F5組分對(duì)細(xì)胞活力的影響有所不同，細(xì)胞活力隨著質(zhì)量濃度的升高總體上呈先增大后隨之減小的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度為6.25～25、100～800 μg/mL時(shí)，各組分對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的體外增殖活性影響不大，當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力有明顯促進(jìn)作用。因此，本試驗(yàn)中選用50 μg/mL作為后續(xù)F及F1～F5研究的計(jì)量濃度。

圖3 裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7的體外增殖活性的影響Fig.3 Effects of sea mustard Undaria pinnatifida fucoidan and its degration oligosaccharides on the proliferation activity of RAW264.7 in vitro

2.3.2 F及F1～F5組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響 利用Griess法測(cè)定50 μg/mL濃度下F及F1～F5組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響。從圖4可見，與空白對(duì)照組相比，LPS促使RAW264.7細(xì)胞被激活釋放大量NO，而F及F1～F5組分可顯著抑制NO的產(chǎn)生，其中F1組分的巖藻寡糖抑制NO產(chǎn)生的作用最為顯著。這表明，低分子量裙帶菜巖藻寡糖抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生過量NO的效果優(yōu)于多糖。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significant differences in different groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences.圖4 巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞生成NO的影響Fig.4 Effects of fucoidan and its degration oligosaccharides on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

2.3.3 F及F1～F5組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子1L-1β、1L-6、1L-10、TNF-α的影響 從表2可見，與空白組相比，LPS能夠誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌大量1L-1β、1L-6、1L-10、TNF-α炎癥因子，加入F及F1～F5組分能顯著降低1L-1β、1L-6、1L-10炎癥因子分泌水平(P<0.05)，而加入低分子量的F1、F2、F3、F4、F能顯著降低TNF-α炎癥因子分泌水平(P<0.05)，降低量隨著巖藻聚糖硫酸酯分子量減小逐漸增大，其中巖藻寡糖F1對(duì)1L-1β、1L-6、1L-10、TNF-α炎癥因子的分泌抑制效果最好，F(xiàn)1組1L-10、TNF-α炎癥因子的釋放水平與空白組效果無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這說明添加F1可以使被LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子1L-10、TNF-α恢復(fù)到空白水平，表明巖藻寡糖F1抗炎效果極好。

表2 巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子的影響Tab.2 Effects of fucoidan and oligosaccharide on lPS-induced secretion of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells

綜上所述，通過ELISA法驗(yàn)證裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥影響，與LPS誘導(dǎo)的炎癥模型組做比較[21]，炎癥因子緩解程度與巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物分子量呈相關(guān)性，巖藻寡糖的抗炎效果優(yōu)于巖藻聚糖硫酸酯，分子量越低的寡糖對(duì)炎癥因子的緩解程度更為顯著。

3 討論

3.1 裙帶菜巖藻寡糖的制備

常用的巖藻寡糖制備方法主要有物理降解法、生物降解法和化學(xué)降解法，其中化學(xué)降解法主要有NaNO2降解、酸降解及氧化降解等方法，而影響酸降解法制備巖藻寡糖效果的因素主要有降解溫度、降解時(shí)間和酸解液pH。本研究中，根據(jù)薄層色譜分析可以確定降解溫度95 ℃、pH 2、處理4 h為稀鹽酸酸解裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯優(yōu)化工藝條件，裙帶菜巖藻寡糖的總回收率為13.53%(F1與F2之和)。劉靜文等[22]將酸解制得的海帶巖藻聚糖硫酸酯粗糖通過自由基氧化降解得到低分子量巖藻聚糖硫酸酯混合物，將該混合物在強(qiáng)陰離子色譜柱中進(jìn)行梯度洗脫，用透析袋脫鹽后凍干得到相對(duì)分子量為5 000～10 000的低分子量巖藻聚糖硫酸酯。鄒祥等[23]用硫酸將由菌株Kosakoniasp.CCTCCM2018092發(fā)酵得到的巖藻多糖發(fā)酵液調(diào)至pH為2～5，60～90 ℃條件下水解4～8 h后，靜置處理后過濾，濃縮、離心、醇沉后得到相對(duì)分子量小于10 000的巖藻寡糖。

耿麗華等[24]從海帶中提取巖藻聚糖硫酸酯寡糖，結(jié)果顯示，降解時(shí)間對(duì)產(chǎn)率影響較?。煌醅摰萚25]利用酸解法降解以海帶、墨角藻、裙帶等褐藻為原料提取的巖藻多糖得到褐藻聚糖硫酸酯寡糖，結(jié)果顯示，鹽酸濃度越高寡糖產(chǎn)率越高，水浴溫度和降解時(shí)間的影響較小，與本試驗(yàn)結(jié)果有相似之處。但本試驗(yàn)中優(yōu)化酸解工藝制備裙帶菜巖藻寡糖效果更好，寡糖的損失率低且有效保留了硫酸基團(tuán)，因此，本酸解法具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 裙帶菜巖藻寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎活性

海洋寡糖在生物體內(nèi)具有多種結(jié)構(gòu)類型和多種靶標(biāo)，許多生物活性與其免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)[26]。Xu等[27]對(duì)比由不同制備方法制備褐藻膠寡糖與大分子量的褐藻膠時(shí)發(fā)現(xiàn)，制得的褐藻膠寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞有活化作用，并發(fā)現(xiàn)酶解制得的非還原端寡糖具有不飽和雙鍵，可以使NF-кB和MAPK信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)NO、ROS和NF-кB、TNF-α的產(chǎn)生，且其活性、分子量、寡糖末端結(jié)構(gòu)與古洛糖醛酸、甘露糖醛酸在分子中的比例相關(guān)。褐藻膠寡糖的末端結(jié)構(gòu)和聚合度對(duì)其活性有較為顯著的影響，褐藻膠及其酶解的寡糖可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌含有膽醛酸的TNF-α，活性最強(qiáng)的是古洛糖醛酸八糖和甘露糖醛酸七糖，而酸解產(chǎn)物末端飽和的寡糖活性很低[27]，這表明，褐藻膠寡糖通過模式識(shí)別受體可增強(qiáng)先天免疫活性。

段慧全等[28]研究裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，把原料分為200、400、800 μg/mL 3個(gè)濃度劑量組處理巨噬細(xì)胞一定時(shí)間，經(jīng)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)，中性紅比色法檢測(cè)當(dāng)濃度為400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞吞噬活性最高達(dá)352.3%，ELISA法檢測(cè)當(dāng)濃度為800 μg/mL時(shí)TNF-α和1L-6的分泌量顯著增加，并且TLR4的表達(dá)還受巖藻聚糖硫酸酯的作用而上升。張祺等[29]以海參為原料提取巖藻聚糖硫酸酯，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中都有重要作用，用MTT法檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖情況均好于空白組和葡聚糖處理組且吞噬能力及免疫功能有顯著提升，巖藻聚糖硫酸酯還能夠調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子間的相互作用，通過TLR4、TLR5、TLR9促進(jìn)MyD88和TRIF的表達(dá)，激活NF-kB的表達(dá)以進(jìn)一步調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能。

本研究結(jié)果表明，酸解制備的不同分子量段的巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物均能有效減少RAW264.7 細(xì)胞NO、1L-1β、1L-6、1L-10和TNF-α的釋放量，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。本研究中還發(fā)現(xiàn)，與LPS誘導(dǎo)的炎癥模型組做比較，炎癥因子釋放緩解程度與巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物分子量呈相關(guān)性，巖藻寡糖抗炎效果優(yōu)于多糖，且添加巖藻寡糖F1可以使被LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子1L-10和TNF-α量恢復(fù)到空白水平，具有極好的抗炎效果。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯寡糖的抗炎活性機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系的研究有很大推動(dòng)作用，高抗炎活性的巖藻寡糖具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景，并為褐藻寡糖類產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了新思路。

4 結(jié)論

1)本研究中優(yōu)化的酸解工藝參數(shù)為95 ℃、pH 2、處理4 h，在此條件下酸解裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯得到的寡糖損失率低，并可有效保留硫酸基團(tuán)。

2)利用膜分離技術(shù)獲得不同分子量段的裙帶菜巖藻聚糖硫酸酯降解產(chǎn)物，均對(duì)巨噬細(xì)胞具有一定的抗炎活性，其對(duì)炎癥因子緩解程度與巖藻聚糖硫酸酯及降解產(chǎn)物分子量呈相關(guān)性，且發(fā)現(xiàn)巖藻寡糖抗炎效果優(yōu)于多糖。