潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜組織及血清中miR-200b和miR-655的表達水平及其臨床意義研究

羅文捷， 張啟芳， 張海蓮， 何思民， 李曉燕， 張 晶， 胡凌佼， 趙 磊

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一類由多種原因引起的以慢性腸道炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，常反復(fù)發(fā)作，病理分型主要有潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD)。黏膜愈合是UC治療好轉(zhuǎn)的目標。微小RNA(microRNA,miRNA)可通過與靶基因序列特異性的相互作用，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達，從而參與細胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程；還能通過影響下游炎癥因子的分泌或參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育、分化過程，調(diào)控慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展[1-2]，甚至對結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生直接影響[3-4]。有研究顯示，miR-200b可維持IBD患者腸上皮完整性[3]，且血清miR-200b的表達水平可反映UC患者疾病的嚴重程度[4]。另外也有研究顯示，miR-655可通過靶向調(diào)節(jié)E盒結(jié)合鋅指蛋白1(zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1)等因子抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)來保持上皮的完整性[5]，但其與UC內(nèi)鏡下活動度的關(guān)系尚未闡明。本研究通過比較UC患者與健康體檢者血清及腸黏膜組織miR-200b、miR-655的相對表達量，探討miR-200b、miR-655表達水平與UC疾病活動的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2016年10月至2019年6月我院消化內(nèi)科收治的UC患者36例，均經(jīng)內(nèi)鏡檢查結(jié)合臨床癥狀進行確診。其中內(nèi)鏡下活動期20例(內(nèi)鏡下活動期組)，內(nèi)鏡下愈合期16例(內(nèi)鏡下愈合期組)。納入標準：(1)年齡20～70歲；(2)符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年，廣州)》[6]中關(guān)于UC的診斷標準；(3)檢查資料完整。排除標準：(1)過去3個月內(nèi)使用過水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等；(2)合并心血管疾病和肝腎疾??；(3)合并惡性腫瘤；(4)孕期婦女；(5)合并其他自身免疫系統(tǒng)疾病。另選擇同期健康志愿者20名作為對照組。所有研究對象簽署知情同意書。內(nèi)鏡下活動期組男13例，女7例，年齡(49.60±13.93)歲。內(nèi)鏡下愈合期組男10例，女6例，年齡(52.69±9.69)歲。對照組男11名，女9名，年齡(51.19±11.69)歲。三組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2UC內(nèi)鏡下活動期及愈合期的判斷方法[6]根據(jù)改良的Mayo評分系統(tǒng)進行診斷分級。見表1。由于Mayo評分對于黏膜愈合無明確定義，本研究以Mayo評分為0～1分定義為愈合期，2～3分定義為活動期。

表1 改良的Mayo評分系統(tǒng)

1.3標本采集

1.3.1 組織標本采集 UC患者及對照組均在行內(nèi)鏡檢查時應(yīng)用活檢鉗取直腸或乙狀結(jié)腸黏膜組織3塊。活動期患者活檢部位為直腸或乙狀結(jié)腸黏膜糜爛或潰瘍處；內(nèi)鏡下愈合期患者活檢部位為直腸或乙狀結(jié)腸愈合黏膜處；對照組活檢部位為正常的直腸黏膜組織。將其中2塊標本經(jīng)液氮速凍后置-80 ℃保存?zhèn)溆茫?塊標本置于福爾馬林液中行病理切片檢查。

1.3.2 血清標本提取 取研究對象肘靜脈血5 ml，分離血清，以5 000 r/min條件離心15 min，提取上清液備檢。

1.4RNA提取 取活檢組織2塊，清洗去除血污后置入潔凈EP管中，加入Trizol(Life生物技術(shù)有限公司)，利用高速組織研磨器對組織進行勻漿，至勻漿液均勻無顆粒。對于血清樣本則直接取凍融血清200 μl置于潔凈EP管中，加入1 ml Trizol，充分混勻。隨后兩者均按1/5體積的比例加入4 ℃的氯仿，劇烈振蕩，充分混勻后冰上放置15 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。小心吸取上層無色液相后加入等體積的異丙醇，輕柔混勻，常溫靜置15 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。取上清液，加入-20 ℃凍存75%乙醇1 ml，輕柔顛倒數(shù)次，8 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清液，所得沉淀為總RNA。室溫下靜置10～15 min，使沉淀自然晾干。隨后加入30 μl ddH2O(血清標本則用20 μl ddH2O)，室溫靜置10 min，使RNA充分溶解，混勻后取2 μl進行RNA純度檢測，其余-80 ℃凍存?zhèn)錂z。

1.5RNA完整性分析 取潔凈電泳槽，配制1%的瓊脂糖凝膠，用移液器吸取總RNA樣品4.5 μl于薄膜上，再加入0.5 μl的10×loading buffer，混勻，將其小心加入點樣孔。電壓設(shè)置為100 V，電泳30 min。瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果可見28 s、18 s及5 s小分子RNA條帶，則說明完整性好；28 s和18 s RNA比值約為2∶1，表明RNA無降解。見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

1.6實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測組織及血清樣本miR-200b、miR-655的表達 應(yīng)用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化)進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。應(yīng)用miRcute增強型miRNA熒光定量試劑盒(天根生化)進行擴增檢測。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。U6(內(nèi)參)、miR-200b、miR-655引物均由GeneCopoeia公司合成。以2-△△Ct法計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1三組腸黏膜組織miR-200b、miR-655表達水平比較 對照組腸黏膜組織miR-200b、miR-655表達水平顯著高于內(nèi)鏡下活動期組和內(nèi)鏡下愈合期組(P<0.05)，而內(nèi)鏡下活動期組與內(nèi)鏡下愈合期組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組腸黏膜組織miR-200b、miR-655表達水平比較相對表達量]

2.2三組血清miR-200b、miR-655表達水平比較 內(nèi)鏡下活動期組血清miR-200b、miR-655水平高于內(nèi)鏡下愈合期組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但后兩組血清miR-200b、miR-655水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 三組血清miR-200b、miR-655表達水平比較相對表達量]

3 討論

3.1IBD可引起腸道通透性和抗原滲透增加，導致腸道上皮屏障損傷[7]。黏膜愈合是UC的一個治療目標，目前已有大量研究證據(jù)表明，黏膜愈合可以維持臨床緩解時間，降低患者住院率及手術(shù)風險，從而改善UC的疾病進程。而內(nèi)鏡檢查是目前評估UC黏膜愈合情況的金標準[8]。

3.2Chen等[3]的研究顯示，活動期IBD患者腸黏膜組織中miR-200b的表達水平顯著低于對照組，miR-200b可通過抑制EMT促進腸上皮細胞的增殖以維持IBD患者腸道上皮的完整性。另外，Yang等[9]的研究也顯示，miR-200家族成員可通過直接靶向下調(diào)ZEB1和E盒結(jié)合鋅指蛋白2(zinc finger E-box-binding protein 2，ZEB2)來抑制腸上皮EMT，促進腸黏膜上皮增生。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b可通過抑制腫瘤壞死因子α、白介素-8的表達，改善腸上皮緊密連接損傷，從而發(fā)揮保護腸上皮屏障的功能[10-11]。本研究結(jié)果顯示，UC患者腸黏膜組織miR-200b表達水平顯著低于對照組，這與上述研究結(jié)論相符。

3.3有研究證據(jù)表明，活動期UC患者血清中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平顯著高于非活動期UC患者及健康者[12]，而miR-200b可直接靶向抑制VEGF的表達[13]。在UC患者的結(jié)腸中，炎性新生血管可激活并募集免疫細胞，促進炎性調(diào)節(jié)因子分泌，導致疾病遷延不愈，抗VEGF抗體可抑制炎性血管生成，緩解IBD疾病進程[14]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)鏡下活動期組血清miR-200b的表達水平顯著高于對照組和內(nèi)鏡下愈合期組，提示UC活動期腸黏膜損傷嚴重，VEGF釋放增多，血清miR-200b可能為代償性增多以抑制VEGF的表達，提示miR-200b參與了UC的發(fā)生、發(fā)展。

3.4miR-655在一些腫瘤細胞中呈低表達，并具有抑制腫瘤的作用，參與了腫瘤細胞的多種生物學過程[15-17]，但其在UC中的表達趨勢及作用尚未闡明。有研究顯示，miR-655可通過靶向調(diào)節(jié)ZEB1等因子抑制EMT，抑制腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，這與miR-200b維持腸黏膜完整性的機制類似[18-19]。也有研究指出miR-655可通過直接靶向作用VEGF抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲[20]，與miR-200b對VEGF的抑制作用相似，但該研究未進行血清中相關(guān)指標的檢測，故其在血清中表達的相互作用尚未可知。本研究結(jié)果顯示，miR-655在UC患者腸黏膜組織中的表達水平顯著低于對照組，但在內(nèi)鏡下活動期組患者血清中的表達卻明顯高于對照組，與miR-200b在UC患者腸黏膜組織及血清中的表達趨勢相似，提示miR-655也可能參與維持腸道上皮的完整性，并通過與VEGF作用，反映腸黏膜的損傷愈合情況，但此推論仍需進一步研究證實。

綜上所述，miR-200b、miR-655在UC患者血清中呈高表達，而在腸黏膜組織中呈低表達，可反映疾病的發(fā)展。但是，本研究樣本量較小，且為單中心研究，對于miR-200b、miR-655作用的具體機制也尚未能夠進行證實，故結(jié)論仍需進一步研究加以驗證。