不同固定液在細(xì)胞蠟塊技術(shù)中的應(yīng)用

黃麗芬 韋花媚 陸小嬋 曾冬云 黃海寧

摘要：目的 研究不同固定液在細(xì)胞蠟塊技術(shù)中的應(yīng)用。方法 使用目前較為常見的三種不同的固定液對(duì)同一陽性涂片漿膜腔液體進(jìn)行處理并制成細(xì)胞蠟塊，對(duì)細(xì)胞蠟塊開展HE染色以及免疫組織化學(xué)染色，通過對(duì)比三種不同固定液作用下的切片效果以及抗體標(biāo)記情況，綜合分析其應(yīng)用效果。結(jié)果 10%中性福爾馬林作為固定液時(shí)HE染色最為清晰，能夠看到完好的細(xì)胞形態(tài)，免疫標(biāo)記定位情況準(zhǔn)確;無水乙醇作為固定液時(shí)HE染色清晰度不佳，少部分細(xì)胞發(fā)生變性，免疫標(biāo)記定位情況一般;甲醇作為固定液時(shí)HE染色清晰度不佳，大部分技術(shù)中的應(yīng)用效果發(fā)現(xiàn)10%中性福爾馬林作為固定液的應(yīng)用效果最好，可以作為制作細(xì)胞蠟塊的首選固定液。

關(guān)鍵詞：固定液;細(xì)胞蠟塊;應(yīng)用效果

【中圖分類號(hào)】Q26 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）03--01

臨床上病理學(xué)診斷的常用方法為脫落細(xì)胞學(xué)檢查，即將脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制成細(xì)胞蠟塊，通過觀察細(xì)胞形態(tài)以及免疫標(biāo)記定位細(xì)胞的方法分析患者的病情，具有迅速、便捷、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，已成為病理檢查常規(guī)方式[1-2]。以往針對(duì)脫落細(xì)胞檢查，臨床多采取傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片，該技術(shù)常因細(xì)胞量不足、細(xì)胞易出現(xiàn)退變、結(jié)構(gòu)不清等因素，增加細(xì)胞學(xué)診斷難度[3-4]。目前薄層液基因細(xì)胞學(xué)檢查，雖可改善傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)的制片質(zhì)量，但該檢查方式處理的細(xì)胞樣本不易獲得細(xì)胞排列方式與背景對(duì)照細(xì)胞，造成難以鑒別可疑與高分化癌細(xì)胞、反應(yīng)性間皮細(xì)胞與間皮瘤[5]。近年來，隨著分子病理檢測(cè)技術(shù)、免疫組化抗體檢測(cè)不斷發(fā)展，體腔積液樣本可提供更多新型檢查方式，細(xì)胞蠟塊技術(shù)的應(yīng)用顯著提升了病理診斷的敏感性與特異性，其可明確積液中細(xì)胞成分分化來源與性質(zhì)，也可為后續(xù)相關(guān)檢測(cè)提供源源不斷的樣本數(shù)量，以此為靶向治療提供有效的理論依據(jù)，具有較為顯著的應(yīng)用價(jià)值【6-7】，但細(xì)胞蠟塊制作使用的固定液種類較多，現(xiàn)在同一個(gè)標(biāo)本上使用多種固定液制定細(xì)胞蠟塊，通過對(duì)比不同固定液下細(xì)胞蠟塊的切片效果以及抗體標(biāo)記情況，綜合分析其應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1一般資料

抽取2019年1月到6月間我院病理科腫瘤性胸腹水1例，選取細(xì)胞學(xué)涂片經(jīng)過病理診斷確定可見癌細(xì)胞。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞蠟塊制作方法

取適量細(xì)胞學(xué)涂片診斷可見癌細(xì)胞的腹水并使用三個(gè)尖底離心管各抽取50毫升，在3000r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行3min的離心處理，將上層清液去除。針對(duì)細(xì)胞量較少的腹水可以進(jìn)行多次離心處理，并保留沉淀物。針對(duì)血性標(biāo)本，在制作細(xì)胞蠟塊前需要去除紅細(xì)胞，首先將血性標(biāo)本放置在離心管內(nèi)進(jìn)行離心處理，將上層清液去除后加入適量冰醋酸酒精液不能并再次離心處理，離心完成后將上層清液去除并加入適量固定液（三個(gè)試管內(nèi)分別加入不同的固定液）。加入固定液后混合均勻并放置一小時(shí)，使用吸管抽取離心管底部的細(xì)胞并放置在顯微鏡擦鏡紙上，包裝完成后放置在自動(dòng)脫水機(jī)內(nèi)進(jìn)行組織處理，將處理好的組織塊進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成細(xì)胞蠟塊。

1.2.2切片與烤片

細(xì)胞蠟塊在冰箱冷凍室內(nèi)放置5到10分鐘后進(jìn)行常規(guī)切片，切片的厚度為4um，最后在65攝氏度的烤箱內(nèi)進(jìn)行烤片1.5小時(shí)。

1.2.3 HE染色及免疫組織化學(xué)染色

對(duì)其中一張切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，其余切片則根據(jù)不同的需求進(jìn)行免疫組織化學(xué)抗體染色。

2結(jié)果

2.1三種不同固定液作用下細(xì)胞蠟塊HE切片情況

10%中性福爾馬林作為固定液時(shí)HE染色最為清晰，顯微鏡觀察下能夠清楚的看到細(xì)胞的排列方式以及分布情況，細(xì)胞輪廓及形態(tài)清晰可見，腫瘤細(xì)胞與周圍的細(xì)胞形態(tài)學(xué)存在明顯差異。無水乙醇作為固定液時(shí)HE染色清晰度不佳，顯微鏡觀察下難以有效觀察細(xì)胞的排列方式以及分布情況，細(xì)胞輪廓及形態(tài)不易辨認(rèn)，腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞的形態(tài)學(xué)之間存在一定差異。甲醇作為固定液時(shí)HE染色情況與95%乙醇類似，清晰度較低，難以有效辨別細(xì)胞形態(tài)，部分細(xì)胞發(fā)生變性，細(xì)胞核體積增大或者固縮。

2.2三種不同固定液作用下免疫組化標(biāo)記結(jié)果

三種不同固定液作用下腫瘤細(xì)胞檢驗(yàn)結(jié)果均為陽性，免疫標(biāo)記定位效果最好的是10%中性福爾馬林作為固定液時(shí)的細(xì)胞切片，無水乙醇與甲醇作用固定液時(shí)細(xì)胞切片的染色效果以及免疫標(biāo)記定位效果相對(duì)較差，但仍可辨認(rèn)出腫瘤細(xì)胞。

3討論

腫瘤性胸腹水在臨床較為常見，主要是指發(fā)生在全身或腹腔中的腫瘤與（或）病變引起的胸腔、腹腔的臟層與（或）壁層胸腹膜發(fā)生彌漫性病變，進(jìn)而造成體腔中液體異常增多的現(xiàn)象[8]。病理診斷中常用的細(xì)胞學(xué)制片方法有細(xì)胞涂片以及液基細(xì)胞學(xué)制片兩種，細(xì)胞涂片具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，是幾乎所有病理科均常規(guī)開展的項(xiàng)目，但其采集細(xì)胞量較少，涂片過程中易出現(xiàn)厚薄不均的問題，因此細(xì)胞涂片下病理診斷的診斷效果受到多種因素的影響，出現(xiàn)誤診與漏診的概率較高。液基細(xì)胞學(xué)制片解決了細(xì)胞涂片中的常見問題，提升了制片的質(zhì)量，但液基細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)破壞了細(xì)胞排列方式，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的鑒別難度增加，而且液基細(xì)胞學(xué)制片對(duì)醫(yī)療設(shè)備的要求較高，大部分的醫(yī)院尚未落實(shí)使用[9]。細(xì)胞蠟塊制作有效結(jié)合了上述兩種細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有保存細(xì)胞新鮮、抗原保留完整等優(yōu)點(diǎn)，在不破壞細(xì)胞排列方式的同時(shí)最大程度的提高了細(xì)胞采集量，且可進(jìn)行多次切片，用于分子檢測(cè)、免疫組化染色、藥物分析、臨床實(shí)驗(yàn)等，可顯著提高細(xì)胞學(xué)診斷陽性率，也可幫助判斷細(xì)胞來源、分型，是目前病理診斷的首選制片方法，有利于對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。在該方法的幫助下，絕大程度上提升了細(xì)胞采集工作的綜合效率，可為病理性診斷的準(zhǔn)確性以及科學(xué)性奠定有效基礎(chǔ)。

近年來，針對(duì)細(xì)胞蠟塊的制作方式已發(fā)現(xiàn)多種，且多數(shù)廠家也產(chǎn)出了細(xì)胞蠟塊制作試劑盒，但目前關(guān)于分析不同固定方法對(duì)細(xì)胞蠟塊制作效果影響的文獻(xiàn)較少。相關(guān)研究顯示，不同固定液會(huì)影響到細(xì)胞蠟塊的效果，目前臨床上使用較多的固定液有10%中性福爾馬林、無水醇以及甲醇三種，均屬于蛋白質(zhì)變性劑，作為固定液使用具有良好的應(yīng)用效果。甲醇還具有神經(jīng)毒素，能夠在患者的體內(nèi)積蓄，甲醛是生物遺傳誘變劑，部分學(xué)者認(rèn)為甲醛還具有致癌作用。乙醇對(duì)人的損害，最重要的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。它使神經(jīng)系統(tǒng)從興奮到高度的抑制，嚴(yán)重地破壞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能?，F(xiàn)使用三種固定液對(duì)同一個(gè)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞蠟塊制作，并綜合評(píng)估不同固定液在細(xì)胞蠟塊技術(shù)中的應(yīng)用效果。研究結(jié)果顯示10%中性福爾馬林作為固定液時(shí)細(xì)胞蠟塊的染色效果最好，且不會(huì)引起細(xì)胞變性等問題，腫瘤細(xì)胞與周圍組織細(xì)胞之間存在明顯的形態(tài)學(xué)差異，給臨床醫(yī)師的鑒別診斷提供了準(zhǔn)確有效的數(shù)據(jù)支持。相對(duì)而言，無水乙醇與甲醇作為固定液的細(xì)胞蠟塊HE染色效果較差，部分細(xì)胞發(fā)生變形而出現(xiàn)形態(tài)改變，但腫瘤細(xì)胞與周圍組織細(xì)胞之間仍具有特異性的形態(tài)學(xué)差異[10]。在制作細(xì)胞蠟塊過程中，使用10%中性福爾馬林固定離心后，細(xì)胞不易凝結(jié)在一起，不利于包埋，在此時(shí)應(yīng)盡可能將試管中液體取出，使用吸管將細(xì)胞沉淀物吸出，放于玻片上，使用濾紙將周圍液體吸干，在細(xì)胞沉淀物上滴上幾滴無水醇，細(xì)胞沉淀凝固成塊，極易制作成細(xì)胞蠟塊，無水醇與12%中性福爾馬林兩者固定較為迅速，細(xì)胞極易結(jié)成塊，有助于細(xì)胞蠟塊制作。

綜上所述，10%中性福爾馬林作為細(xì)胞蠟塊的固定液具有更為顯著的應(yīng)用價(jià)值，適宜推薦使用。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊新， 王秋實(shí)， 李艷青，等. 細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化有效提高胸水細(xì)胞學(xué)陽性檢出率的臨床研究[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)， 2014， 22（12）：2894-2897.

[2]夏玉榮， 陳貞， 馬琴，等. 蛋清細(xì)胞蠟塊輔助液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)在體液轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 40（3）：112-114.

[3]吳冬梅， 吳艷霞， 袁振興，等. 細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化技術(shù)在提高肺癌胸水細(xì)胞學(xué)陽性檢出率及提供分型診斷方面的應(yīng)用價(jià)值分析[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué)， 2018，78（5）：9-12.

[4]羅瑩，吳荔香，詹燕美.RASSF1A，p16及Ki67在宮頸液基細(xì)胞蠟塊中的表達(dá)及意義[J].福建醫(yī)藥雜志，2016，38（6）：92-96.

[5]陳雪，周炳娟，孫吉瑞，等.子宮內(nèi)膜細(xì)胞蠟塊切片在子宮內(nèi)膜癌早期診斷的應(yīng)用[J].臨床與病理雜志，2018，38（3）：485-489.

[6]羅娟，王麗麗，閻紅琳，等.痰液細(xì)胞蠟塊在肺癌診斷中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志，2020，27（3）：212-213，215.

[7]梁忠泉，劉暢，楊志娜，等.脂肪組織石蠟切片制作方法探討[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2019，28（2）：170-173.

[8]劉甜，劉嘉敏，陳意，等.細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)、分子病理在胸腔積液病理診斷中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志，2021，28（2）：152-154.

[9]施丹飛，崔戈，李勇.兩種血性胸腔積液的細(xì)胞蠟塊制作方法對(duì)制片結(jié)果的影響[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，51（11）：917-919.

[10]熊基玲.傳統(tǒng)涂片與細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化在滲出性胸腔積液診斷中的價(jià)值[J].醫(yī)療裝備，2021，34（5）：55-56.

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