膳食膽酸對大鼠糖脂代謝及腸道菌群的影響

陳 說,張 帆,吳佩嫻,范艷飛,彭衛(wèi)群,洪小瑜

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東 深圳 518036)

近年來,腸道菌群被視為一種內(nèi)分泌器官,其結(jié)構(gòu)和功能的改變在肥胖發(fā)生中占據(jù)重要作用[1],逐漸成為研究熱點(diǎn)。膽汁酸由肝臟合成經(jīng)膽總管分泌入腸道可以促進(jìn)脂類消化吸收；作為信號分子,調(diào)節(jié)機(jī)體的糖脂代謝；參與維持腸道正常功能[2]。膽汁酸膳食是否引起體內(nèi)膽汁酸水平的變化及其對機(jī)體代謝及腸道菌群的影響尚未明確。本研究通過建立高脂大鼠模型和普通飼料添加膽汁酸喂養(yǎng)的大鼠模型,檢測血液中膽汁酸、白細(xì)胞介素(IL)-18、瘦素以及糞便中擬桿菌門和厚壁菌門的比例,通過與正常對照組比較,初步探討膽汁酸膳食可能通過激活炎性反應(yīng)和改變腸道誘導(dǎo)大鼠的代謝指標(biāo)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,進(jìn)而為脂肪肝及肥胖的防治提供新的方向。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑：8周齡的SD雄性大鼠(斯萊克公司),高脂飼料(斯萊克公司),去氧膽酸(Sigma-aldrich公司),生化指標(biāo)檢測試劑盒(中生北控生物公司),大鼠瘦素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、大鼠IL-18 ELISA試劑盒、糞便基因組提取試劑盒(DP328-02) (天根生化科技有限公司),SYBRGreen Realtime PCR Master Mix(QPK-201) (TOYOBO公司)Premix Taq Version 2.0(TAKARA公司),10*TBE(Promega公司)。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立:健康8周齡的SD雄性大鼠30只,動(dòng)物等級SPF,體重160～180 g。先統(tǒng)一喂養(yǎng)正常飼料7 d,第7天進(jìn)行體重的稱量并采集每只動(dòng)物的糞便樣品,為零時(shí)刻樣品。此后隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成三組,第一組對照組10只大鼠喂食正常飼料；第二組高脂飲食組10只大鼠喂食高脂飼料；第三組膽酸組10只大鼠喂養(yǎng)正常飼料+膽酸(100 mg/kg)；以上三組均1次/d，共8周。

1.2.2樣本收集:實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食和飲水,共喂養(yǎng)56 d,每10天收集上述三組共30只大鼠新鮮糞便樣本(采用逼迫法收集)用于檢測腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化,一共收集5次；從分組時(shí)的零時(shí)刻開始每周對三組大鼠進(jìn)行體重的稱量,每天觀察大鼠的皮毛色澤、飲食變化、活動(dòng)狀態(tài)及糞便形態(tài),以評價(jià)大鼠的表象特征。實(shí)驗(yàn)分組期末,各組禁食12 h,用戊巴比妥將大鼠麻醉,注射器采血后立即離心分離血清、血漿。測定血清空腹血糖(FBG)、丙氨酶氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、總膽汁酸(TBA)。放免法測定空腹胰島素(FINS)。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：FBS×FINS/22.5。

1.2.3ELISA樣本準(zhǔn)備,收集血清100 μl/孔；按試劑盒說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；每孔加100 μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣本,37℃孵育1 h每孔加100 μl檢測試劑A,37℃孵育1 h緩沖液洗滌3次；每孔加100 μl檢測試劑A,37℃孵育30 min；緩沖液洗滌3次；每孔加入90 μl基質(zhì)溶液，室溫孵育30 min,50 μl終止溶液終止；450 nm讀取OD值。

1.2.4腸道菌群RT-PCR:糞便基因組提取試劑盒提取各樣品基因組DNA,并檢測DNA濃度,調(diào)整各樣品DNA濃度至10 ng/μl；利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測各樣品中厚壁菌群,擬桿菌群基因的相對含量。計(jì)算如下：對應(yīng)樣品中目標(biāo)基因Xn的相對含量=2-ΔΔCT,ΔΔCT=ΔCTxn-ΔCTA1；其中ΔCTxn為對照組目的基因減去內(nèi)參基因β-actin的循環(huán)數(shù),ΔCTA1為干預(yù)組目的基因減去內(nèi)參基因β-actin的循環(huán)數(shù)；通過以上計(jì)算方法計(jì)算各樣品厚壁菌群、擬桿菌群基因相對含量。

2 結(jié)果

2.1高脂飼料和膽汁酸喂養(yǎng)對大鼠血清生化指標(biāo)的影響：與對照組相比,高脂飲食組及膽酸組血清中FBG、TC、TG、TBA、ALT和FFA均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；膽酸組的升高不如高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。表明高脂飲食組和膽酸組均可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)糖、脂代謝紊亂、肝功能異常,但膽酸組的影響小于高脂飲食組。

2.2高脂飼料和膽汁酸喂養(yǎng)對大鼠體重及血清IL-18和瘦素的影響：三組大鼠在干預(yù)前體重?zé)o明顯差異,喂養(yǎng)期間體重均穩(wěn)定增加,干預(yù)結(jié)束時(shí)高脂飲食組及膽酸組大鼠的體重增量較正常組高但無顯著差異,而血清HOMA-IR、 IL-18和瘦素明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中高脂飲食組血清中IL-18和瘦素較膽酸組升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),相關(guān)分析顯示,HOMA-IR與血清FFA、IL-18、瘦素水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r分別為0.85,0.72,0.87,均P<0.01),血清瘦素及IL-18之間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.89,P<0.01)。見表2。提示膽酸干預(yù)與高脂喂養(yǎng)均可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗及炎性反應(yīng)并導(dǎo)致體重增加,而膽酸組的影響小于高脂飲食組。

表1 各組大鼠血清中生化指標(biāo)

表2 各組大鼠體重增量及血清中IL-18和瘦素水平

2.3高脂飼料和膽汁酸喂養(yǎng)對大鼠腸道菌群基因表達(dá)的影響：與對照組相比,高脂飲食組和膽酸組大鼠糞便中的厚壁菌群基因表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而且在高脂飲食組更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1；擬桿菌群基因則表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2；擬桿菌群與厚壁菌群比例呈下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。后兩者在高脂飲食組和膽酸組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與對照組比較,①P<0.01；與高脂飲食組比較,②P<0.01圖1 各組大鼠糞便中厚壁菌群的基因表達(dá)量

注：與對照組比較,①P<0.01圖2 各組大鼠糞便中擬桿菌群的基因表達(dá)量

注：與對照組比較,①P<0.01圖3 各組大鼠糞便中擬桿菌群與厚壁菌群表達(dá)的比例

3 討論

不同的膳食結(jié)構(gòu)對糖脂代謝存在明顯影響,本研究中高脂模型組大鼠TG、TC、TBA、ALT水平高于正常對照組,體重有增加趨勢但差異不明顯考慮可能與喂養(yǎng)周期較短及喂養(yǎng)末期大鼠產(chǎn)生厭食相關(guān)。這與既往在高脂喂養(yǎng)大鼠模型中觀察到的結(jié)果類似[3]。高脂飲食對糖脂代謝產(chǎn)生影響機(jī)制主要在于肝內(nèi)膽汁酸淤積、干擾肝臟處理血脂能力,導(dǎo)致多余的脂肪在肝臟及體內(nèi)臟器累積,血漿中脂肪酸升高,最終引起血脂代謝紊亂、肥胖等疾病的發(fā)生[4]。本研究中觀察到8周的去氧膽酸膳食在大鼠體內(nèi)可代謝為脫氧膽酸(屬于疏水性膽汁酸),形成血漿中膽汁酸堆積,FFA增加及血脂代謝紊亂?？赡艿臋C(jī)制在于疏水性膽汁酸可溶解細(xì)胞膜膜脂,從而引起細(xì)胞壞死[5-6],誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用及體內(nèi)血清膽固醇的水平增高[7]。膽酸組大鼠轉(zhuǎn)氨酶異常并伴隨膽固醇升高,也間接證實(shí)了膽汁酸喂養(yǎng)可能通過肝細(xì)胞毒性作用進(jìn)而引起血脂異常。

高脂飲食能夠誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗,其機(jī)制主要涉及瘦素、細(xì)胞炎性因子的分泌增加。高胰島素血癥可增加脂肪細(xì)胞瘦素的表達(dá),由此形成高瘦素與胰島素抵抗間的惡性循環(huán)。IL-18是腫瘤壞死因子(TNF)-α的誘導(dǎo)因子,通過其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中激酶如c-Jun氨基末端激酶(JNK)、NF-κB、IKB激酶(IKK)等和細(xì)胞因子信號抑制物(SOCS)的激活,阻礙正常的酪氨酸磷酸化而導(dǎo)致IR和肥胖[8]。本研究結(jié)果顯示,膽酸喂養(yǎng)大鼠血清中瘦素及IL-18、HOMA-IR升高,其可能機(jī)制為膽汁酸攝入后在體內(nèi)代謝為脫氧膽汁酸,可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列慢性炎性反應(yīng)表現(xiàn)為瘦素及IL-18的升高。正常情況下瘦素增加可抑制胰島素分泌,但本研究中發(fā)現(xiàn)大鼠胰島素水平并未下降,提示可能發(fā)生了瘦素抵抗。李靜芳等[9]也發(fā)現(xiàn)在脂代謝紊亂的早期,機(jī)體發(fā)生瘦素抵抗,使得瘦素作用減弱,發(fā)生脂肪肝,血清瘦素濃度的代償增加,可反映出肝內(nèi)膽汁沉積的程度[10]。結(jié)合本研究的結(jié)果,推斷膽汁酸可誘導(dǎo)大鼠增加瘦素分泌及炎性反應(yīng)從而引起胰島素抵抗。

有研究在人體和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),肥胖個(gè)體腸道中擬桿菌門細(xì)菌的含量下降,而厚壁菌門細(xì)菌的比例相對升高[11-12]。高脂飲食引起的肝細(xì)胞脂肪堆積和胰島素抵抗可導(dǎo)致膽汁酸淤積和膽汁酸成分改變,從而導(dǎo)致腸道菌群失衡,進(jìn)一步加重膽汁酸代謝紊亂和肝臟炎性反應(yīng)[13-14]。Janssen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠喂食牛磺膽酸(TCA)引起腸道菌群結(jié)構(gòu)改變,加劇肝臟炎性反應(yīng)和肝纖維化。將膽汁酸加入正常小鼠飲食出現(xiàn)體質(zhì)指數(shù)升高,且其腸道菌群結(jié)構(gòu)近似肥胖小鼠；而將膽汁酸受體激動(dòng)劑加入高脂小鼠飲食,膽汁酸合成受到抑制,小鼠體質(zhì)指數(shù)、腸道菌群結(jié)構(gòu)均趨向正常[16]。本研究中膽酸喂養(yǎng)后大鼠糞便內(nèi)的厚壁菌群數(shù)量上升,擬桿菌群數(shù)量下降,擬桿菌群/厚壁菌群比例下降,證明膽汁酸膳食可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生類似高脂模型的腸道菌群改變進(jìn)而參與了胰島素抵抗的發(fā)生,但膽汁酸調(diào)控腸道菌群參與肥胖、糖尿病的具體機(jī)制比較復(fù)雜,仍需要進(jìn)一步深入研究。展望未來,干預(yù)膽汁酸代謝的膳食結(jié)構(gòu)有望成為改善高脂血癥、糖尿病、肥胖等代謝性疾病的新方向。