結(jié)腸直腸癌患者腸道黏膜區(qū)域的菌群分布

結(jié)腸直腸癌（CRC）是目前世界上最常見的癌癥之一，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2018年大腸癌的發(fā)病率排名第3（＞180萬例）、死亡率排名第2（＞86萬例）。近年來，中國CRC的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢，造成的醫(yī)療負(fù)擔(dān)也在逐年增。與眾多非傳染性疾病一樣，大腸內(nèi)腫瘤的形成是多因素的，其主要影響因素可歸結(jié)為兩類：遺傳因素和環(huán)境因素。根據(jù)家族和雙胞胎調(diào)查數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，遺傳因素造成的CRC發(fā)病人數(shù)僅占總數(shù)的12%～35%，環(huán)境因素對(duì)CRC的發(fā)生影響更大。

“人民、只有人民，才是創(chuàng)造歷史的動(dòng)力?！比吮竟芾砭褪且髲淖鹬厝恕㈥P(guān)心人、愛護(hù)人、理解人的角度對(duì)人的成長和發(fā)展負(fù)責(zé)，尊重人性，倡導(dǎo)人倫，關(guān)注情感。具體來講，人本管理制度主要包括：

水位/流量反推法也是一種理論方法。該法主要思路和算法如下：①選取控制斷面，確定斷面歷史最高水位和預(yù)警水位等指標(biāo)，計(jì)算水位流量關(guān)系；②繪出各頻率不同時(shí)段下（1 h、3 h、6 h）降雨的暴雨頻率曲線圖；③確定各暴雨頻率下 1 h、3 h、6 h降雨形成的斷面洪水過程線；④繪制各頻率洪水洪峰流量與暴雨頻率關(guān)系的曲線；⑤根據(jù)特征流量，從各頻率洪水洪峰流量與暴雨頻率關(guān)系圖中查出該值對(duì)應(yīng)的頻率值；⑥根據(jù)該頻率值，從暴雨頻率曲線上確定降雨量，該降雨量即可作為臨界雨量值。這種方法對(duì)資料的要求較高，并且假定洪水與暴雨同頻率。

腸道微生物對(duì)宿主健康的主導(dǎo)作用被大量報(bào)道。雖然人類在100多年前就發(fā)現(xiàn)腸道微生物代謝產(chǎn)物會(huì)參與宿主體內(nèi)代謝與循環(huán)，但直到最近宿主-微生物代謝相互作用才引起科學(xué)界的廣泛興趣，現(xiàn)在人們對(duì)腸道微生物的認(rèn)知已經(jīng)發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變。人類身體健康狀況與腸道微生物組的變化息息相關(guān)，而宏基因組學(xué)分析作為一種有效的腸道微生物研究工具，在疾病與腸道微生態(tài)變化的研究中有極其廣泛的應(yīng)用，目前在對(duì)CRC患者腸道菌群宏基因組學(xué)的研究表明，腸道菌群紊亂對(duì)CRC發(fā)生和發(fā)展有重大的促進(jìn)作用。

近年來對(duì)CRC患者糞便宏基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成與生長與某些特定的糞便微生物有直接關(guān)聯(lián)，例如脆弱擬桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌等。腸道菌群的失調(diào)與糞便菌群的改變會(huì)增加腸道黏膜的通透性，加劇腸道黏膜上皮損傷，最終導(dǎo)致腸道腫瘤惡化。研究表明CRC患者糞便與正常人糞便的微生物菌群存在差異，而CRC患者腫瘤黏膜與瘤旁黏膜微生物的組成存在結(jié)構(gòu)上的差異，所以在腸道疾病研究中，黏膜微生物組的研究可能比糞便微生物組的研究更能反映病變部位微生態(tài)的改變。

從天津市人民醫(yī)院、天津市腫瘤醫(yī)院和附近地區(qū)收集了33例個(gè)體糞便及部分黏膜樣本（通過手術(shù)取得），包括13 例CRC 患者（年齡40～77 歲）糞便樣本，6 例CRC患者腫瘤部位黏膜和鄰近非腫瘤部位黏膜，20例健康人群糞便（年齡40～65歲，無任何腸道疾?。＜{入標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)量指數(shù)在正常范圍之內(nèi)，無超重或肥胖；既往無結(jié)直腸手術(shù)史；無家族性腺瘤性息肉病或遺傳性非息肉性大腸癌的患者；無炎癥性腸病（IBD）、代謝性疾?。ㄈ缣悄虿　⒎逝?、高脂血癥）或感染性疾病的患者、無嚴(yán)重肝腎疾病、無免疫缺陷；在收集標(biāo)本之前3個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用過抗生素或皮質(zhì)類固醇激素或益生菌；無特殊飲食習(xí)慣。作為本研究的一部分，所有進(jìn)行的調(diào)查均以1993年修訂的1975年“赫爾辛基宣言”為指導(dǎo)方針進(jìn)行，所有參與者均表示知情同意，本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

“銀行說是上級(jí)行卡了規(guī)模，另外也覺得這筆貸款有風(fēng)險(xiǎn)。我向銀行解釋過，這家大企業(yè)信譽(yù)良好，回款及時(shí)，不會(huì)拖欠我們的款項(xiàng)，而且我自己企業(yè)的回款賬戶可以放在銀行，還有什么擔(dān)心的呢？但銀行還是說不行。我覺得銀行在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估手段上可以更靈活一些，仔細(xì)調(diào)研，不要一覺得有風(fēng)險(xiǎn)就干脆不做貸款了?！鳖櫪^宏說。

1 資料和方法

1.1 樣本的獲取

雖然有研究已經(jīng)揭示了癌變部位黏液層微生物群與糞便微生物群在腫瘤發(fā)展過程起到了關(guān)鍵性作用，但當(dāng)前研究并未綜合比較糞便菌群、正常黏液層菌群和腫瘤黏液層菌群之間的關(guān)聯(lián)性，以及不同來源微生物對(duì)CRC愈后的影響。本研究通過采用二代測序技術(shù)對(duì)CRC患者的糞便及腸道黏膜細(xì)菌菌群16S rDNA進(jìn)行高通量測序并對(duì)菌群組成進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析并比較了腫瘤處黏膜微生物和非腫瘤處黏膜微生物與糞便微生物的關(guān)聯(lián)性。除此之外，本研究還采用流式細(xì)胞儀對(duì)CRC患者和正常人的糞便細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行了測定，分離并測試不同來源細(xì)菌菌株對(duì)腸癌細(xì)胞的毒性，探索了對(duì)治療CRC患者可能有益的腸道細(xì)菌和潛在的治療靶標(biāo)，為CRC的防治提供了新的思路和理論依據(jù)。

1.2 16S rDNA測序技術(shù)對(duì)糞便、黏膜微生物區(qū)系的分析

本實(shí)驗(yàn)中，16S rDNA測序技術(shù)在華大基因股份有限公司HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行。采用總DNA提取試劑盒提取糞便及黏膜樣本菌群DNA，取質(zhì)量合格的DNA提取液（30 ng/μL）及對(duì)應(yīng)的融合引物配制PCR反應(yīng)體系對(duì)菌群rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，建庫完成后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測。檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測糞便細(xì)菌總數(shù)

乳酸脫氫酶（LDH）存在于多種細(xì)胞中正常情況下不會(huì)分泌到胞外，所以胞外外LDH往往用于評(píng)估細(xì)胞凋亡和毒性通過。比較分菌株與癌細(xì)胞共培養(yǎng)后培養(yǎng)液中LDH含可得出各分離各菌株對(duì)不同細(xì)異的細(xì)胞毒差異性。對(duì)于HT-29細(xì)胞系，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡而其6種它細(xì)菌都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖6A）。對(duì)于LoVo細(xì)胞系，、和保護(hù)細(xì)胞免于凋亡而顯著促進(jìn)其凋亡（＜0.0001，圖6B）。在HCT-116 細(xì)胞系中，、、和促進(jìn)了細(xì)胞凋亡（圖6C）。綜合分析不分離源源的細(xì)菌對(duì)3株細(xì)胞系的毒性分析，來自CRC患者腫處瘤黏膜的B.fragilis 1（而不是來自于瘤旁黏膜的B.fragilis 2）顯著促進(jìn)了3株癌細(xì)胞的凋亡（＜0.0001），但F.nucleatu抑制護(hù)了HT-29和LoVo細(xì)的于自然凋亡（圖6）。

1.4 糞便及黏膜中細(xì)菌分離

從圖3C可以看出，與CRC患者的糞便和黏膜相比，健康人群糞便擁有更豐富的、、。同比下CRC 患者糞便特有的菌株為（圖3C）。CRC患者正常黏膜上含有較為豐富的、、等黏膜定植菌株，這些菌群的豐度在CRC 患者腫處瘤黏膜上明顯降低（圖3D）。相反的，CRC 患者腫瘤處黏膜表現(xiàn)為、、等腸道致病菌豐度增高。健康人群糞便OTUs組成與CRC患者存在較大差異，腫瘤處黏膜微生物PCA組成與CRC患者糞便相似，而非腫瘤處黏膜微生物PCA組成則交叉分布于健康人群糞便和CRC患者糞便之中（圖4A）。PLS-DA（圖4B）更為清晰CRC患者糞便微生物菌群與明腫瘤處黏膜微生菌群僅有僅部重合成。因此，糞便微生物可能同時(shí)受到腫瘤和非腫瘤黏膜微生物組成的影響。正常人糞菌群便與CRC患者糞菌群便及黏膜菌群組成差異較大，且CRC患者的糞便、腫瘤黏膜及瘤旁黏膜菌群也存的差異。

1.5 7株細(xì)菌對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)

為了研究從CRC患者糞便、腫瘤或瘤旁黏膜中分離得到的7株細(xì)菌對(duì)3種結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的毒性大小，本實(shí)驗(yàn)采用乳酸脫氫酶檢測試劑盒評(píng)估了腸癌細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)。選取3 種人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HT-29、HCT-116和LoVo作為測試細(xì)胞，測試了從CRC癌患者腫瘤黏液中分離的Bacteroides fragilis 1、Enterococcus avium和Fusobacterium nucleatum；以及從瘤旁黏液中分離的B.fragilis 2、Ruminococcus gnavus；CRC癌患者糞便中分離的Lachnospira.sp.和.7株菌的毒性作用，具體方法為：

先將3株HT-29、HCT-116、LoVo結(jié)腸直腸癌細(xì)胞以5×10/mL置于6孔板中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，再向每個(gè)孔中分別加入10 μL 7株細(xì)菌菌液（細(xì)菌濃度為1.0×10CFU/mL），置于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完畢之后，吸出1 mL培養(yǎng)基到1.5 mL離心管中，2500 r/min離心5 min，置于冰上待測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，制作數(shù)據(jù)圖。采用Student's檢驗(yàn)組間差異。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的實(shí)驗(yàn)都設(shè)置3組平行。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者糞便菌群與健康人群糞便的差異

流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，患者單位質(zhì)量的糞便細(xì)菌含量要少于正常人群糞便（圖1A～C）。16S rDNA測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CRC 患者的糞便菌群運(yùn)算分類單位（OTUs）與正常人的交集為450、CRC患者特有的OTUs數(shù)值為145、健康人群特有的OTUs數(shù)值為356（圖1D）。

隨著時(shí)代的發(fā)展，全球范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率在持?jǐn)嗌?，作為發(fā)病率最的高癌癥之，的CRC一直威脅著人類的健康。癌癥的誘發(fā)和惡化與腸道菌群的改相關(guān)，通過補(bǔ)充有益菌或移除有害菌可有效以改善腫瘤惡化。糞便菌群常用于性反映腸道菌變化情況，因此本研究對(duì)正常人和CRC患者糞便菌群進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)健康人群特有的微生物的種要大于CRC患者。通過觀測CRC患者的平均物種觀測值、chao指數(shù)、ace指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)CRC 患者的糞便微生物的α-多樣性要低于健康人群，而相關(guān)有研也究指出腸道菌群α-多樣性高的個(gè)相對(duì)能更健康。在收集糞便時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)CRC患者大多伴隨著慢性腹瀉現(xiàn)象，而這種與癌癥相關(guān)的腹瀉，與腸道中微生物的含量及多樣性變化有關(guān)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)患者單位質(zhì)量糞便含量的細(xì)菌總數(shù)要少于正常人群糞便。通過二代測序?qū)颖揪哼M(jìn)行16S rDNA測序分析我們發(fā)現(xiàn)，健康人群腸道微生物的種類要多于CRC患者。

主成分分析（PCA）是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的技術(shù)，通過降維尋找變量間的共線性關(guān)系。通過分析不同樣本OTUs組成可以反映樣本間的差異和距離。偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，根據(jù)觀察或測量到的若干變量值，來判斷研究對(duì)象如何分類的常用統(tǒng)計(jì)分析方法。PCA和PLS-DA的結(jié)果顯示CRC患者和健康人群的糞便菌群在組成上有明顯的差異性（圖2A～B）。這種特異性可通過去除二者糞便共有菌而顯現(xiàn)出來（圖2C）。LEfSe分析聚類圖（圖2C）顯示CRC患者具有多種獨(dú)有的Clostridiales 存在，而健康人群則表現(xiàn)為特有的TuricibacteraceaeFlavobacteriales 等菌株。關(guān)鍵物種差異比較柱狀圖（圖2D）比較發(fā)現(xiàn)，在豐度前10的物種（目）中CRC患者表現(xiàn)為Clostridiales 和Bifidobacteriales 占有比例顯著增高（＜0.05），而Lactobacillales、Bacteroidales、Enterobacteriales等菌所比例降低。通過對(duì)CRC 患者與健康人群糞便中的Escherichia、Enterococcus、Fusobacterium 相對(duì)豐度比較發(fā)現(xiàn)，兩者差別不明顯（圖2E）。

2.2 CRC患者糞便與其腸道黏膜的微生物比較

從CRC患者糞便、腫瘤黏膜及非腫瘤處黏膜菌群的韋恩圖（圖3A）可以看出非腫瘤處黏膜菌群OTUs組成與患者糞便交集數(shù)值更大，而腫瘤處黏膜菌OTUs組成與二者的交集數(shù)值相對(duì)較小。此外，非腫瘤處黏膜與糞便菌OTUs總值均高于腫瘤處黏膜。因此，CRC患者糞便細(xì)菌種類更接近于正常黏膜而不是腫瘤處黏膜。對(duì)比3者的物種觀測值、chao指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)及simpson指數(shù)（圖3B），非腫瘤處黏膜菌群的α-多樣性更，高而糞便和腫瘤黏膜的α-多性樣更為接近。

取0.1 g糞便樣本或適量黏膜樣本，加入無菌生理鹽水后碾磨混勻，10倍梯度稀釋至10倍，在稀釋度為10、10、10的試管中各吸取0.1 mL分別傾注在凝固的NB、MRS、RCM、BHI、YPD培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布、涂布至均勻無水痕后倒置放入培養(yǎng)溫度為37 ℃的厭氧培養(yǎng)箱中，充入氣體組成為80%N、10%H、10%CO的混合氣培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)完畢后取出，選取菌落數(shù)為100左右的平板，挑取所有菌落至相應(yīng)液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h。采用16S rDNA片段擴(kuò)增測序的方法進(jìn)行對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定，16S rDNA擴(kuò)增片段所采用的引物是V3-4F5'-GACTACHVGGGTATCTAATC C-3'和V3-4R 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物測序序列在采用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行3次重復(fù)PCR驗(yàn)證菌株鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 糞便及黏膜中菌群的分離

腸道菌群在癌癥發(fā)生過程中扮演著重要的作用，但在實(shí)際研究中腸道內(nèi)菌群的變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，飲食結(jié)構(gòu)及環(huán)境因素可以顯著影響糞便菌群結(jié)構(gòu)。黏膜上的微生物多以黏蛋白作為固定營養(yǎng)來源且被腸道黏膜包裹，因此其在短期內(nèi)受到外界環(huán)境因素（如腹瀉）影響的可能性相對(duì)較小。本研究為了更直觀比較CRC患者糞便菌群組成與黏膜菌群組成的差別，在比較PCA和PLS-DA時(shí)還加入健康人群糞便樣本作為對(duì)照。另外，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CRC患者糞便與癌變黏膜菌群α-多樣性相似度高但菌成菌株間差異較大，這表明糞便與黏膜微生物組成雖然相似但存在差異。該研究結(jié)果與大數(shù)據(jù)追蹤C(jī)RC患者腫瘤惡化情況的結(jié)論相近，說明黏膜菌群的改變?cè)诨颊吣[瘤發(fā)生過程中貢獻(xiàn)率更大。

本次調(diào)查抽取的44例接受DIEP乳房重建術(shù)的患者中，有12例發(fā)生引流管留置時(shí)間延長（＞7天），占27.27%。

2.4 7種分離菌株菌對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)

流式細(xì)胞儀檢測糞便中細(xì)菌總數(shù)如先前報(bào)道。新鮮糞便樣本在150 r/min的條件下勻質(zhì)5 min，取0.2 g勻質(zhì)后的糞便樣本用生理鹽水（0.85%）稀釋到10倍，采用孔徑為5 μm的無菌濾器去除雜質(zhì)。隨后取1 mL的稀釋液液中加入1 μL SYBR Green I工作染料(1∶100稀釋于二甲亞砜中；37 ℃孵育15 min）。使用C6 Accuri流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）對(duì)懸浮液中存在的微生物細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。熒光事件監(jiān)測使用FL1 533/30 nm和FL3 ＞670 nm光學(xué)探測器。對(duì)前方和側(cè)面散射的光線進(jìn)行收集。利用BD Accuri CFlow軟件將FL1、FL3密度圖上的微生物熒光事件與糞便樣本背景進(jìn)行門控和分離。在FL1 通道上應(yīng)用了一個(gè)閾值2000。門控?zé)晒馐录谡騻?cè)方密度圖上進(jìn)行評(píng)估，以排除剩余的背景事件并獲得準(zhǔn)確的微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有樣本的儀器和門控參數(shù)設(shè)置相同。

人生最難得的就是，愿意沉下心來將一件事做到極致，哪怕已經(jīng)取得了萬眾矚目的成績，鞏俐仍選擇將自己的全部精力都放在鐘愛的事業(yè)上。因?yàn)樯苜F，經(jīng)不起浪費(fèi)。

3 討論

CRC患者的平均物種觀測值、chao指數(shù)、ace指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)均低于健康人群，而辛普森指數(shù)高于健康人群（圖1E），由此可以得出CRC患者的糞便微生物的α-多樣性顯著低于健康人群（＜0.05）。

本研究通過PCA和PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)，健康人群的糞菌組成、CRC患者的糞菌組成的特異性不同，這一結(jié)論與既往的研究相符。比較健康人群與CRC患者糞便菌群組成可知健康人群具有較高豐度的及，而CRC 患者糞便中、、豐度較高，王新穎等研究也得到了相應(yīng)結(jié)論。其中部分、等菌的存在被認(rèn)為對(duì)腸道是有益的，而有大量研究報(bào)道指出等菌株對(duì)腸道健康是不可或缺的，但CRC患者糞便中含有較高豐度的其是否與CRC的形成相關(guān)有待于進(jìn)一步去研究。雖然僅通過比較觀測到某一或多個(gè)微生物群在CRC患者腸道中富集而斷定其與癌癥的發(fā)生存在因果關(guān)系是不可取的，但值得注意的是，患者糞便中的一些特異性微生物可能有利于CRC的預(yù)防及診斷防治。

通過對(duì)健康人群、CRC患者糞便及黏膜分離出的菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可以發(fā)現(xiàn)易分培養(yǎng)離的種屬相對(duì)較少（僅16種，16SrDNA二代測序顯示術(shù)有30種）。比較組種菌群鑒定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，16SrDNA二代A測術(shù)（圖5A）與分菌鑒定出的菌株（圖5B）得出的結(jié)論較為相似，如CRC 患者糞便及黏膜具有較高豐度的Escherichia 和Enterococcus，健康人群糞便具有豐富較高的Clostridium，CRC患者非腫瘤黏膜上具有較高豐度的Bacteroides及Ruminococcus。

2.7控制飲水量。在經(jīng)過栓塞治療好轉(zhuǎn)的當(dāng)天夜晚凌晨四點(diǎn)患者尿液再次由淡黃色轉(zhuǎn)成淡紅色,于次日教授查房時(shí)指導(dǎo)患者減少飲水量,通過濃縮尿液減少出血,方法是除了正常的三餐飲食不另外攝入水份,三餐以清淡高蛋白飲食為主,例如米飯,雞蛋魚類肉類,避免湯,減少鹽的攝入量,減少口渴感,從而減少水的攝入量。間斷的夾閉尿管,定時(shí)的開放,三天的飲水控制患者尿量維持在1000-2000ml/d,尿液淡紅清亮,未見暗紅色,每天清晨查血常規(guī),血色素未見明顯下降。

在比較CRC患者糞便及其腫瘤/非腫瘤黏膜菌群時(shí)我們發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與糞便菌群比較結(jié)果完全不同，即CRC患者非腫瘤黏膜上含有較為豐富的、、等黏膜定植菌株，而腫瘤處黏膜中、、等腸道致病菌豐度顯著增高，這與既往的研究相符。

CLIL是一種把學(xué)科內(nèi)容和語言學(xué)習(xí)結(jié)合在一起的方法，既促進(jìn)了學(xué)科知識(shí)的學(xué)習(xí)，又提升了學(xué)生的二語或外語能力，在西方國家已經(jīng)獲得了長足的發(fā)展。在中國，CLIL教學(xué)法還有較大的發(fā)展空間，在CLIL教學(xué)理念的觀照下大力培養(yǎng)航海英語師資，必將促進(jìn)我國航海英語教學(xué)。

黏膜定植菌株通常反映腸黏膜的健康狀態(tài)，而等菌則與腫瘤細(xì)胞代謝異常相關(guān)。

通過對(duì)糞便及黏膜中微生物分離可知多數(shù)潛在的病原菌和有益菌都是可以分離培養(yǎng)的，潛在有害菌可以經(jīng)體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其致病機(jī)理及如何預(yù)防，而潛在有益菌也可以經(jīng)實(shí)驗(yàn)開發(fā)為益生菌產(chǎn)品用于疾病的預(yù)防及治療。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中本研究發(fā)現(xiàn)分離自CRC患者的微生物對(duì)三株癌細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的毒性，來自于CRC患者腫瘤黏膜的1可以顯著促進(jìn)腸癌細(xì)胞的凋亡（＜0.0001），而可以顯著保護(hù)腸癌細(xì)胞免于凋亡（＜0.001）。有研究表明會(huì)促進(jìn)CRC的發(fā)展。另外也有研究對(duì)非產(chǎn)毒素的脆弱芽孢桿菌與免疫系統(tǒng)關(guān)系的進(jìn)行了研究，表明部分脆弱芽孢桿菌菌株可能是防治CRC的潛在益生菌。因此，腫瘤黏膜定植的可能是防治CRC的潛在有益菌，而抑制在黏膜定植可能是CRC的潛在防治手段。

在腸鏡或手術(shù)前后都需要短時(shí)間調(diào)整飲食并服用相關(guān)藥物，這些措施可能會(huì)顯著影響腸道黏液表層的微生物結(jié)構(gòu)，黏液層深處因有黏液包裹而受到的干擾較小。在本研究中，我們是選擇的樣本為手術(shù)所取的6例CRC患者腫瘤或瘤旁內(nèi)層黏膜，相比于通過腸鏡取得的黏膜而言，更能代表腸道黏膜菌群分布情況。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CRC患者糞便與腫瘤黏膜菌群α-多樣性上有較高的相似性，但與CRC相關(guān)的核心菌群卻完全不同。我們研究了不同來源的細(xì)菌對(duì)癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)來源于腫瘤黏膜處的細(xì)菌與癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)性更強(qiáng)。雖然糞便和黏膜菌群在研究CRC患者腫瘤發(fā)生中都具有其各自的特性，但經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后表明黏膜菌群中一些定植菌株可能與腸道腫瘤發(fā)展關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)，這一研究結(jié)論有望為CRC的防治提供重要的線索和參考。