CaMK Ⅱ在小鼠重癥急性胰腺炎胰腺損傷中的作用

重癥急性胰腺炎（SAP）是一種較高致死率的炎性疾病，亢進(jìn)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）與多器官功能衰竭。目前已經(jīng)證實(shí)，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高可以促進(jìn)胰蛋白酶原激活和釋放，加重組織損傷。組織損傷因子的釋放誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)水平升高進(jìn)而調(diào)控IL-1β、TNF-α等炎癥因子的水平的轉(zhuǎn)錄來參與SAP的局部炎癥反應(yīng)；局部炎癥反應(yīng)進(jìn)一步可能發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能衰竭。因此，探索控制全身炎癥進(jìn)展的措施，對于SAP救治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

鈣調(diào)素依賴蛋白激酶（CaMK Ⅱ）可以通過調(diào)控細(xì)胞膜及肌質(zhì)網(wǎng)的鈣通道來調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度，進(jìn)而參與細(xì)胞的重要病理生理進(jìn)程。研究表明，CaM KⅡ蛋白與胰腺疾病的病理生理過程有密切的聯(lián)系。除了通過細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度參與機(jī)體病理生理過程外，CaMKⅡ還可通過抑制NF-κB來參與調(diào)控疾病進(jìn)程。但是CaMK Ⅱ蛋白在重癥急性胰腺炎中的作用尚無深入研究。因此，本研究通過構(gòu)建小鼠SAP模型，探索CaMK Ⅱ在SAP疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。此外我們還通過CAMK Ⅱ特異性抑制劑KN93進(jìn)行對CaMK Ⅱ進(jìn)行抑制，進(jìn)一步明確其發(fā)揮作用的機(jī)制。

對于故障代碼“P160900 碰撞切斷已觸發(fā)，主動(dòng)/靜態(tài)”，需執(zhí)行轉(zhuǎn)向系控制單元基本設(shè)置。具體操作方法如下：

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

6～8周雄性SPF級C57小鼠36只（重慶恩斯維爾生物科技有限公司），體質(zhì)量20～25 g。?；悄懰徕c（Sigma）。小鼠血清淀粉酶、脂肪酶ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），TNF-α、IL-6、IL-10ELISA試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）。全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶公司）、Trizol試劑（Invitrogen）、BCA蛋白定量試劑盒（博士德）、抗CaMK Ⅱ單克隆抗體（Abcam）?？筃F-κB單克隆抗體、抗p-NF-κB單克隆抗體、抗p-CaMK Ⅱ單克隆抗體、抗ERK單克隆抗體、抗p-ERK單克隆抗體（CST）?？笹APDH 單克隆抗體（武漢Proteintech）。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（二抗）（Abcam）。山羊抗兔IgG抗體（二抗）（CST）。CaMK Ⅱ蛋白抑制劑KN93（MedChem Express）。RT-PCR 引物（廣州銳博生物技術(shù)有限公司），異氟烷麻醉劑（深圳瑞沃德）。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

SAP模型構(gòu)造：將36只C57小鼠置于實(shí)驗(yàn)室IVC籠具適應(yīng)1周，12 h晝夜交替光照，造模前禁食不禁水12 h，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為4 組：假手術(shù)組（Sham 組）、抑制劑組（KN93 組）、重癥急性胰腺炎組（SAP 組）、抑制劑和急性重癥胰腺炎組（KN93+SAP組），9只/組。所有小鼠實(shí)驗(yàn)操作均采用異氟烷進(jìn)行吸入性麻醉。Sham組小鼠麻醉后，開腹后翻動(dòng)數(shù)次胰腺后關(guān)腹。SAP組小鼠麻醉后，開腹后十二指腸降段處確定胰膽管開口處，動(dòng)脈夾夾閉胰膽管上端，用1 mL注射器經(jīng)胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c（1 mL/kg）誘導(dǎo)SAP。KN93組開腹后翻動(dòng)數(shù)次胰腺以后關(guān)腹，同時(shí)尾靜脈注射KN93（1 mg/kg）。KN93+SAP組開腹后經(jīng)胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c（1 mL/kg）誘導(dǎo)SAP并且同時(shí)尾靜脈注射KN93（1 mg/kg）。實(shí)驗(yàn)過程均符合單位及國家相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)定，遵循了國際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會《關(guān)于動(dòng)物倫理與福利的作者指南共識》。

1.3 標(biāo)本采集

于建模后24 h分批進(jìn)行取材，收集胰腺組織和血液。血液常溫靜置15 min后立刻離心（3000 r/min，15 min），收集上清液置于-80 ℃冰箱中凍存。胰腺組織分為兩份，一份保存于-80 ℃冰箱用于蛋白質(zhì)提取，另一份用4%甲醛固定后期用于相關(guān)檢測。

教育學(xué)家杜威說，學(xué)校首要責(zé)任是給孩子提供一個(gè)簡化的環(huán)境，以排除社會環(huán)境中丑陋現(xiàn)象對兒童的影響。面對社會功利化的競爭環(huán)境，家庭和學(xué)校更應(yīng)當(dāng)正確引導(dǎo)孩子的競爭意識。兒童的價(jià)值體系還沒有健全，對于競爭概念的判斷不清晰，所謂的競爭意識也是我們強(qiáng)加給孩子的，如果因?yàn)椤氨容^”、因?yàn)椤案偁帯?，他們心里容不下比自己?qiáng)的伙伴，這算不算一種心理缺失？

1.4 病理評估

嚴(yán)格依照ELISA試劑盒說明書測定血清中淀粉酶、脂肪酶、IL-6、IL-10與腫瘤壞死因子α的濃度。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

胰腺組織甲醛固定后進(jìn)行脫水、包埋、切片、58 ℃烤片脫蠟，依次進(jìn)行蘇木素、伊紅處理，自然晾干1 h后封片，于Leica DM300光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀察胰腺結(jié)構(gòu)。由兩個(gè)病理醫(yī)師對胰腺病理進(jìn)行獨(dú)立評分，通過計(jì)算每張病理切片選取的10個(gè)視野的平均分得出最后評分。

為提升企業(yè)運(yùn)營管理基礎(chǔ)能力，以“提質(zhì)增效”為管理核心，公司全面梳理采購管理、庫存管理、供應(yīng)商管理、財(cái)務(wù)管理等公司管理的基礎(chǔ)、薄弱環(huán)節(jié)，建設(shè)統(tǒng)一的物資管理信息化平臺，解決不同部門之間業(yè)務(wù)協(xié)同問題，實(shí)現(xiàn)物流、資金流和信息流統(tǒng)一，消除各類“信息孤島”，實(shí)現(xiàn)公司范圍內(nèi)信息的良好互通與共享，及時(shí)掌握物資保障及經(jīng)費(fèi)執(zhí)行情況，為領(lǐng)導(dǎo)科學(xué)決策提供支持。

1.6 免疫蛋白印跡

綜上所述，通過企業(yè)號的實(shí)施，打破時(shí)空管理約束，隨時(shí)、隨地、隨手辦公交流，醫(yī)護(hù)人員再也不用找空閑電腦接收文件，一個(gè)手機(jī)端，就能輕松實(shí)現(xiàn)便捷的辦公平臺，無空間的溝通場所，為院內(nèi)職工創(chuàng)造一個(gè)高效的工作環(huán)境，增強(qiáng)凝聚力，提高工作積極性，以“集成、溝通、協(xié)作”為中心整體提升醫(yī)院的精細(xì)化管理水平和綜合服務(wù)形象。

1.7 免疫組織化學(xué)

采用免疫組織化學(xué)方法檢測胰腺組織中NF-κB的表達(dá)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟對包埋的胰腺組織進(jìn)行切片后58 ℃烤片3 h，透明劑脫蠟10 min、pH=9的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液煮沸10 min，山羊血清封閉過夜，次日滴加兔抗小鼠NF-κB（1∶1000）抗體在4 ℃下孵育12 h。新配PBS溶液溫和沖洗切片后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1∶200），37 ℃孵箱孵育1 h。一次進(jìn)行DAB染色，分化，反藍(lán)后封片，在Leica DM300光學(xué)顯微鏡下觀察陽性染色并采集圖像。

1.8 RT-PCR

HE染色結(jié)果顯示，SAP小鼠的胰腺結(jié)構(gòu)可見明顯的破壞，出現(xiàn)大片壞死，組織水腫，小葉結(jié)構(gòu)消失，炎癥細(xì)胞浸潤（圖1A、B）。相比Sham組，SAP組促炎因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高（＜0.01，圖1C），同時(shí)SAP組小鼠血清脂肪酶和淀粉酶也升高（＜0.01，圖1D），小鼠的SAP模型成功構(gòu)建。

依照全蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行小鼠胰腺組織的蛋白質(zhì)提取，并用BCA法測定胰腺總蛋白水平。蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后與CaMK Ⅱ（1∶4000）單克隆抗體、p-CaMK Ⅱ（1∶1000）、NF-κB（1∶1000）單克隆抗體、p-NF-κB（1∶1000）單克隆抗體、ERK（1∶1000）單克隆抗體、p-ERK（1∶1000）單克隆抗體、GAPDH（1∶10000）單克隆抗體、反應(yīng)，于4 ℃環(huán)境下孵育12 h。次日用新配TBST洗滌3次后與二抗（1∶2000）孵育1 h，TBST洗滌曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用ImageJ采集圖像、計(jì)算灰度值。

免疫組化染色結(jié)果顯示，SAP組胰腺組織的NF-κB表達(dá)水平相比于Sham組升高；CaMK Ⅱ被抑制后，SAP組胰腺組織NF-κB的蛋白含量下降（圖4A）。Western blot 結(jié)果顯示，SAP 組的NF-κB 磷酸化水平相比于Sham 組明顯增高（圖4B）；但CaMK Ⅱ蛋白被抑制后，蛋白ERK的磷酸化水平降低，NF-κB的活性也被抑制（圖4B、C）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

注射KN93以后，KN93+SAP組的小鼠的胰腺損傷減輕（圖3A）。相比于SAP組的小鼠，KN93+SAP組的小鼠的血清淀粉酶和脂肪酶降低（＜0.05，圖3B、C）。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血清IL-6、TNF-α的水平降低，抑炎因子IL-10水平升高（＜0.05，圖3E～G）。

2 結(jié)果

2.1 SAP小鼠模型成功構(gòu)建

RT-PCR測定胰腺組織CaMK ⅡmRNA的表達(dá)水平。采用TRIzol法提取胰腺組織總RNA，并用分光光度儀檢測總RNA的含量和純度，/比值在1.9～2.0的樣本符合要求。依照一步法RT-PCR 對CaMK ⅡmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

2.2 CaMK Ⅱ蛋白在SAP組胰腺組織中活性升高

RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SAP組小鼠胰腺組織總CaMK Ⅱ（T-CaMK Ⅱ）表達(dá)水平相較于Sham組沒有明顯變化（＞0.05，圖2A、B）。但是，SAP組小鼠p-CaMK Ⅱ的蛋白表達(dá)量比假手術(shù)組升高（＜0.001，圖2B）。

2.3 抑制CaMK Ⅱ可有效減輕SAP小鼠的胰腺損傷

采用GraphPad prism9.2和SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素ANOVA 方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 抑制CaMK Ⅱ后NF-κB蛋白降低，SAP的炎癥緩解

若不失一般性,令t=k,由于n-k≥3,n≥5,故?An-1,k-1.所以在內(nèi)存在一個(gè)哈密頓圈C,C={u,P,v,Q,u},則

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)CaMK Ⅱ蛋白在SAP小鼠的胰腺組織中活性明顯升高，抑制CaMK Ⅱ可以有效抑制SAP的胰腺損傷和降低全身炎癥反應(yīng)，表明CaMK Ⅱ參與SAP的進(jìn)展。CaMK Ⅱ在SAP當(dāng)中的作用在既往研究中還未有明確探索，因此探明其在SAP發(fā)生發(fā)展過程中的作用及相關(guān)的機(jī)制有助于進(jìn)一步認(rèn)識SAP的發(fā)病機(jī)制及尋找可能的治療靶點(diǎn)。CaMK Ⅱ?yàn)橐环N多聚體蛋白，受到刺激后，自身Thr286或Thr287位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，Thr286位點(diǎn)自磷酸化后促進(jìn)酶亞基相互磷酸化，亞基磷酸化后具有捕捉鈣調(diào)蛋白能力，進(jìn)而促進(jìn)全酶活化發(fā)揮作用。CaMK Ⅱ在許多疾病進(jìn)展中起著重要作用。研究顯示，當(dāng)CaMK Ⅱ抑制劑和吡喹酮同時(shí)使用后，血吸蟲病的治療效果明顯改善；在心臟中，CaMK Ⅱ被發(fā)現(xiàn)可以通過蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1來調(diào)節(jié)心臟的收縮功能。不僅如此，CaMK Ⅱ在胰腺疾病中也發(fā)揮著重要的作用。在高糖刺激下，CaMK Ⅱ蛋白可以發(fā)生自身磷酸化來誘導(dǎo)ERK 的激活，最終促進(jìn)胰島素的分泌。CaMK Ⅱ還被發(fā)現(xiàn)與炎癥密切相關(guān)。但是CaMK Ⅱ在SAP發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制還不清楚。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SAP小鼠中CaMK Ⅱ的磷酸化水平明顯增高，當(dāng)CaMK Ⅱ的活性被KN93抑制后，SAP小鼠的胰腺損傷明顯減輕，全身炎癥明顯改善，與CaMKⅡ在其他疾病中的作用一致。進(jìn)一步提示CaMK Ⅱ可能參與促進(jìn)SAP小鼠的全身炎癥的發(fā)生發(fā)展。有研究表明在人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，CaMK Ⅱ可以通過ERK/NF-κB 信號通路促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的金屬蛋白酶9 的表達(dá)。在未分化的小鼠骨髓單核細(xì)胞中，KN93可以通過抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和Akt的表達(dá)來抑制NF-κB的表達(dá)。而NF-κB作為促炎細(xì)胞因子分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是胰腺炎早期的重要分子。大量激活的胰蛋白酶原造成組織損傷，細(xì)胞破裂。組織細(xì)胞破裂釋放大量組織因子，誘導(dǎo)NF-κB從無活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问健Ｒ环矫?，NF-κB多聚體的IκB激酶解離，NF-κB發(fā)揮作用促進(jìn)TNF-α的轉(zhuǎn)錄。另一方面，NF-κB的激活導(dǎo)致胰腺中性粒細(xì)胞大幅度增加，大量促炎因子和黏附分子流入胰腺，加重胰腺炎癥反應(yīng)。組織損傷后中性粒細(xì)胞由胰腺局部擴(kuò)散至肝臟、肺等組織器官，進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，使用KN93抑制CaMK Ⅱ后，NF-κB的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的降低，同時(shí)血清中的促炎因子IL-6/TNF-α明顯降低，抗炎因子IL-10明顯升高，表明CaMK Ⅱ可能通過增加NF-κB的表達(dá)參與SAP進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)在SAP進(jìn)展早期進(jìn)行KN93干預(yù)，降低CaMK Ⅱ的活性從而減少NF-κB的表達(dá)，進(jìn)一步減少IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄。

在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中，CaMK Ⅱ可以通過負(fù)向調(diào)控ERK/MAPK信號通路來降低NF-κB的表達(dá)，減輕神經(jīng)炎癥水平。在急性胰腺炎中ERK/MAPK信號通路已經(jīng)被證實(shí)發(fā)揮重要作用，其機(jī)制是通過上調(diào)NF-κB來參與SAP的胰腺進(jìn)展。急性胰腺炎中，黃芩素抑制ERK/MAPK信號通路和NF-κB表達(dá)水平來降低急性胰腺炎的炎癥水平。氧化苦參堿可以通過降低ERK/MAPK途徑蛋白的表達(dá)水平來降低NF-κB的表達(dá)，減輕急性胰腺炎的胰腺損傷和炎癥水平。川穹素可以通過抑制ERK/MAPK信號通路來減輕急性胰腺炎的胰腺損傷，同時(shí)也能在體外使用AR42J細(xì)胞觀察到當(dāng)ERK/MAPK通路被抑制后，細(xì)胞的炎癥因子也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CaMK Ⅱ的活性被抑制后，ERK（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶）蛋白的磷酸化水平明顯降低，提示CaMK Ⅱ通過抑制ERK/MAPK信號通路來降低IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。

缺齒蓑蘚(Macromitrium gymnostomum Sull. & Lesq.)為木靈蘚科(Orthotrichaceae)蓑蘚屬(Macromitrium)植物。該物種主莖匍匐、側(cè)枝短，枝葉中上部細(xì)胞近方形、密被多疣，細(xì)胞間界線模糊；下部和基部細(xì)胞光滑無疣，細(xì)胞壁直；孢蒴蒴口下皺縮，蒴口下有縱棱，蒴齒退化；蒴帽兜形，光滑無毛。主要分布于我國華東、華南和西南地區(qū)，在亞洲的日本、朝鮮半島、中南半島也有分布[1]。

綜上所述，抑制CaMK Ⅱ可能通過抑制ERK/MAPK信號途徑來減少NF-κB的蛋白水平，最終緩解SAP的炎癥程度。但是CaMK Ⅱ與ERK之間具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究去探索和發(fā)現(xiàn)。CaMK Ⅱ可能是治療SAP炎癥反應(yīng)的一個(gè)新的靶點(diǎn)。