繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥來(lái)源的甲狀旁腺原代細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

甲狀旁腺主細(xì)胞在機(jī)體甲狀旁腺素(PTH)的分泌和體內(nèi)鈣磷代謝等方面發(fā)揮著重要作用，進(jìn)而參與包括繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥（SHPT）在內(nèi)的多種疾病的病理過(guò)程。SHPT的主要特征為PTH升高，而PTH的合成和分泌受到甲狀旁腺細(xì)胞膜上鈣敏感受體（CaSR）的調(diào)節(jié)。既往研究表明，在甲狀旁腺的發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子2（GCM2）特異性表達(dá)，是關(guān)鍵的調(diào)控因子。目前，對(duì)SHPT的相關(guān)研究多局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體的病理學(xué)檢查等，關(guān)于人來(lái)源的原代甲狀旁腺細(xì)胞模型僅存在于原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)（PHPT）中，尚缺乏SHPT人來(lái)源的原代甲狀旁腺細(xì)胞模型，存在實(shí)驗(yàn)受限于多種復(fù)雜因素影響、細(xì)胞內(nèi)相關(guān)機(jī)制難以闡明、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類存在先天差異性及病理學(xué)檢查存在實(shí)驗(yàn)局限性等諸多缺點(diǎn)。因此，建立SHPT原代細(xì)胞模型對(duì)進(jìn)一步的研究至關(guān)重要。本研究通過(guò)對(duì)培養(yǎng)的SHPT細(xì)胞進(jìn)行PTH、CaSR和GCM2的檢測(cè)，成功分離并建立了原代甲狀旁腺細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究SHPT的發(fā)病機(jī)制、藥物療效、調(diào)控機(jī)制等提供了前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人甲狀旁腺原代細(xì)胞（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院）。DMEM/F12培養(yǎng)液（賽默飛世爾公司）。細(xì)胞膠原酶I（BIOSHARP），胎牛血清（Gibco），熒光標(biāo)記二抗（湖南艾佳生物公司），PTH兔源多抗（ABclonal），CaSR兔源多抗（Bioss），GCM2兔源多抗（Bioss），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（Li-Cor），LightCycler-4800II PCR儀（Roche）等。

在環(huán)境檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)處理的相關(guān)研究中，以往研究多注重在檢測(cè)結(jié)果的自動(dòng)處理[10]．構(gòu)建檢測(cè)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)試系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)模塊、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)模塊和綜合評(píng)價(jià)系統(tǒng)模塊，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)環(huán)境數(shù)據(jù)的自動(dòng)處理、匯總及分析評(píng)價(jià)系統(tǒng)，避免中間環(huán)節(jié)中數(shù)據(jù)人為記錄、匯總的誤差，提高了工作效率．高效、準(zhǔn)確的環(huán)境檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)認(rèn)清環(huán)境現(xiàn)狀和相關(guān)部門的正確決策有重要意義．

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 收集2019年6～12月中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院10例接受外科手術(shù)治療的SHPT患者的異常甲狀旁腺組織。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：18歲以上；慢性腎臟病患者，常規(guī)行超聲和99mTcMIBI甲狀旁腺顯像的繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥患者；已知情同意；所有SHPT患者都有多個(gè)的甲狀旁腺增生，SHPT是根據(jù)血清鈣和完整的PTH水平診斷的，沒有其他可能的高鈣血癥的原因；患者常規(guī)行超聲和核素顯像以定位甲狀旁腺，并通過(guò)手術(shù)病理確定其是否為結(jié)節(jié)樣增生甲狀旁腺。實(shí)驗(yàn)組排除標(biāo)準(zhǔn)：全身活動(dòng)性感染、嚴(yán)重肝病、活動(dòng)性惡性腫瘤（甲狀腺癌除外）、甲狀旁腺切除術(shù)史、妊娠和免疫抑制劑治療。

陡河水庫(kù)大壩坐落在砂層地基上，大壩全長(zhǎng) 7 364 m，其中主壩長(zhǎng)1 700 m，位于河床一級(jí)臺(tái)地上；副壩長(zhǎng)5 664 m,位于二級(jí)臺(tái)地上。主壩地基普遍分布有輕壤土，地基表面高程25.0～26.0 m， 下有4.0～5.0 m輕壤土，再下為細(xì)砂層。

2.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及PTH測(cè)定 甲狀旁腺細(xì)胞生長(zhǎng)較勻速且緩慢，其細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為71.61 h。PTH檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的甲狀旁腺細(xì)胞持續(xù)分泌PTH，并隨時(shí)間推移濃度逐漸降低，P0代及P1代原代細(xì)胞的PTH分泌相對(duì)穩(wěn)定，P2代PTH分泌則下降明顯（圖2）。

1.2.4 細(xì)胞的傳代 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，使用與培養(yǎng)基等量的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2～3遍后，加入0.25%胰酶，傾斜培養(yǎng)皿使其遍布培養(yǎng)皿的底部區(qū)域，置于恒溫培養(yǎng)箱中消化2 min左右，在顯微鏡下觀察可見貼壁的細(xì)胞脫落后呈圓形透亮，懸浮其中，加入配置好的完全培養(yǎng)基終止消化，使用滅菌后的吸頭反復(fù)吹打培養(yǎng)皿底部區(qū)域使細(xì)胞完全脫落，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中離心5 min，設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)1000 r/min，r=16 cm，棄掉上清液后加入預(yù)熱好的新鮮的完全培養(yǎng)基，吹打重懸后置入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。隔日換液，每次換液后留取上清液檢測(cè)PTH含量，剩余凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 原代細(xì)胞的提取 使用膠原酶法提取甲狀旁腺細(xì)胞。在培養(yǎng)基中用眼科剪將甲狀旁腺組織標(biāo)本切碎成約0.5～1.0 mm的碎片，PBS溶液洗滌3遍，然后轉(zhuǎn)移至離心管中加入足量的0.2%膠原酶I溶液，添加1.5%小牛血清和1.25 mmol/L CaCl，震蕩消化30 min，離心5 min，吸出棄上清液。加入PBS緩沖液重懸消化的組織后，經(jīng)100 μm濾網(wǎng)中過(guò)濾，濾過(guò)的消化殘留物可根據(jù)情況加入膠原酶I再次消化。將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液再次離心5 min，吸出上清液。加入配置好的適量RPMI 1640完全培養(yǎng)液，使用血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/mL，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此為P0代細(xì)胞。隔日換液，每次換液后留取上清液檢測(cè)PTH含量，剩余凍存于-80 ℃冰箱中。

在食品、制藥和化學(xué)工業(yè)中，乳酸的作用和應(yīng)用日益廣泛，同時(shí)在許多化合物的合成中，乳酸也是重要的中間體或者組成部分[49]。菊芋作為生產(chǎn)乳酸的原料，成本更低。同時(shí)利用菊芋也有可能產(chǎn)生多種化學(xué)物質(zhì)[50-52]，如琥珀酸、丁酸、2，3-丁二醇、檸檬酸和山梨糖醇等。

1.2.5 PTH 檢測(cè) 使用嘉慧生物人甲狀旁腺(PTH)ELISA試劑盒進(jìn)行P0、P1及P2代甲狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)液的PTH檢測(cè)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度值。

1.2.6 測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將培養(yǎng)的P0代甲狀旁腺細(xì)胞消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，約1 mL/孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h收集3孔細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取均值。將均值取log10的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性擬合，描繪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。

使用Graphpad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用檢驗(yàn)或者配對(duì)檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.1 基因及蛋白表達(dá)檢測(cè) qRT-PCR結(jié)果顯示，P0代細(xì)胞中CaSR 表達(dá)高于P1 代細(xì)胞（0.996±0.0130.865±0.027，=0.017），而PTH（1.010±0.0040.985±0.033，=0.572）與GCM2（0.987±0.0241.004±0.092，=0.892）在P0及P1代細(xì)胞中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A）。Western blot結(jié)果顯示，P1代細(xì)胞CaSR蛋白表達(dá)水平較P0代細(xì)胞下降（0.417±0.0270.247±0.017，=0.006），而PTH（0.541±0.0560.581±0.058，=0.625）與GCM2（0.934±0.0280.912±0.018，=0.689）蛋白表達(dá)水平在P0及P1代細(xì)胞中表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B～E）。

1.2.9 Western blot測(cè)定細(xì)胞特異蛋白的表達(dá) 收集P0及P1代分離純化后的細(xì)胞，用蛋白裂解液在冰上裂解細(xì)胞。加入樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，再加入一抗過(guò)夜。第2天TBST洗滌3次后，加入二抗常溫孵育1 h。TBST清洗后，加入顯影液拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

1.2.7 免疫熒光染色 取P1代甲狀旁腺細(xì)胞，冰凍切片，PBS洗片3×5 min。消除非特異性背景染色：滴加正常山羊血清封閉液（PBS稀釋）室溫20 min后甩去液體，PBS洗片3×5 min。滴加一抗：4 ℃過(guò)夜，之后37 ℃復(fù)溫30 min或37 ℃孵育1 h，PBS洗片3次，5 min/次。滴加熒光素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育60 min。PBS洗片3次，5 min/次?？篃晒獯銣鐒┓馄R檢。

2 結(jié)果

2.1 SHPT患者臨床特征

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 使用膠原酶法提取甲狀旁腺細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。P0代細(xì)胞消化過(guò)濾后混勻時(shí)細(xì)胞呈圓形透明，散在分布，細(xì)胞貼壁后呈多角形或者紡錘形，細(xì)胞緩慢增殖。待細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿后傳代，第1次傳代的細(xì)胞為P1，貼壁后與原代細(xì)胞大致相似，絕大多數(shù)呈梭形，少部分細(xì)胞呈多角形，胞漿均質(zhì)透明，且生長(zhǎng)緩慢。直至第3次傳代細(xì)胞P3，貼壁后細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞依舊大致相似（圖1A）。

2.2 SHPT細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)

本研究納入的10例SHPT組織樣本的患者均為女性，年齡30～63歲，甲狀旁腺病理類型：SHPT患者均為結(jié)節(jié)狀甲狀旁腺增生，對(duì)照組患者均為正常甲狀旁腺，且PTH在SHPT患者中增高。

2.2.2 P1代細(xì)胞免疫熒光染色 使用PTH兔源一抗和熒光標(biāo)記二抗以及DAPI染液標(biāo)記P1代細(xì)胞后，可見所有細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光（圖1B），胞質(zhì)顯示綠色熒光，細(xì)胞核周圍熒光濃度相對(duì)較高（圖1C）。

1.2.2 標(biāo)本處理 甲狀旁腺切除術(shù)中切取標(biāo)本腺體中央的部分甲狀旁腺組織，生理鹽水沖洗后擠出血液，將腺體立即放入裝有4 ℃無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)溶液的離心管中，在30 min內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室提取原代細(xì)胞，其余的甲狀旁腺常規(guī)送病理活檢。

許多刑事案件的被害人與犯罪嫌疑人、被告人之間沖突的爆發(fā)往往是由于雙方在交往的過(guò)程中，彼此存在著個(gè)性的差異或利益分配不均衡等因素導(dǎo)致了矛盾的產(chǎn)生，而此種矛盾又沒有及時(shí)得到正確、有效的處理所致。因此運(yùn)用證偽思維審查被害人陳述，可以更好地通過(guò)全面認(rèn)識(shí)被害人陳述來(lái)幫助辦案人員排除被害人的虛假陳述，指明偵查方向，正確分析案件情況，排除被害人陳述的虛假部分，及時(shí)糾正辦案過(guò)程中的偏差，節(jié)省辦案資源,提高辦案質(zhì)量。

2.3 P0代細(xì)胞和P1代細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.2.8 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)差異表達(dá)的mRNAs 表達(dá)水平，采用染料法（SYBR Green I）用LightCycler-4800II PCR儀進(jìn)行Real-time定量PCR分析，內(nèi)參選用GAPDH，所有引物由銳博生物公司設(shè)計(jì)并合成（表1）。

臨床藥物劑量可以根據(jù)理想體質(zhì)量、總體質(zhì)量、瘦體質(zhì)量計(jì)算得出。但目前關(guān)于產(chǎn)婦的全麻藥物劑量的最佳計(jì)算方法尚無(wú)共識(shí)。研究[2]認(rèn)為，根據(jù)瘦體質(zhì)量計(jì)算的丙泊酚誘導(dǎo)劑量不足以引起意識(shí)喪失；而總體質(zhì)量更適用于肥胖患者[3]。本研究采用總體質(zhì)量來(lái)計(jì)算產(chǎn)婦的誘導(dǎo)劑量。

3 討論

CKD 患者由于腎臟功能改變導(dǎo)致體內(nèi)鈣、磷及1,25(OH)D等代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)PTH水平增加，逐步進(jìn)展為SHPT，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的研究尚處于早期階段，目前缺乏人類來(lái)源的甲狀旁腺細(xì)胞系。國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用了牛、人、大鼠等不同物種的甲狀旁腺進(jìn)行了原代細(xì)胞的提取，發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺細(xì)胞在體外生長(zhǎng)緩慢，難以長(zhǎng)期培養(yǎng)?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)對(duì)于人甲狀旁腺原代細(xì)胞的提取多以PHPT患者來(lái)源為主，而部分學(xué)者認(rèn)為SHPT患者增生的甲狀旁腺可能更適合體外培養(yǎng)，但實(shí)驗(yàn)需要在短期內(nèi)進(jìn)行。

本研究探討了SHPT患者甲狀旁腺原代細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的可行性，使用10例SHPT患者的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行甲狀旁腺細(xì)胞的培養(yǎng)，最終成功分離了SHPT甲狀旁腺原代細(xì)胞。在P0代細(xì)胞培養(yǎng)期間，分散的細(xì)胞貼壁后顯微鏡下觀察大致呈現(xiàn)多角形或者紡錘形；而P3代細(xì)胞貼壁后與原代細(xì)胞大致相似，絕大多數(shù)呈梭形，少部分細(xì)胞呈多角形，這與既往研究所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)大致相似。相比之下，本研究的培養(yǎng)方法更加完善，原代細(xì)胞的純度、傳代數(shù)、傳代時(shí)間較前均有提升。實(shí)驗(yàn)顯示，在P0和P1代細(xì)胞中GCM2、PTH、CaSR蛋白均有表達(dá)。而PTH是甲狀旁腺主細(xì)胞特異性分泌的激素，GCM2只在甲狀旁腺細(xì)胞中特異性表達(dá)，說(shuō)明本研究培養(yǎng)的細(xì)胞為甲狀旁腺來(lái)源。本研究成功培養(yǎng)的SHPT來(lái)源甲狀旁腺原代細(xì)胞的意義在于準(zhǔn)確把握體外培養(yǎng)可靠的有效期，實(shí)驗(yàn)證明在P0、P1代細(xì)胞具有體細(xì)胞相似性，有效培養(yǎng)時(shí)間為14 d左右，證明可通過(guò)體外培養(yǎng)P0、P1代甲狀旁腺細(xì)胞期間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，達(dá)到探討SHPT分子機(jī)制研究的目的。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，甲狀旁腺細(xì)胞PTH分泌的濃度隨時(shí)間呈逐漸減少的趨勢(shì)，且在傳代后分泌減慢，GCM2在P0代細(xì)胞與P1代細(xì)胞的表達(dá)無(wú)明顯差異，結(jié)合其mRNA及蛋白水平研究，提示傳代后的細(xì)胞PTH分泌的減少可能是由于分泌水平或者PTH降解途徑的變化，而細(xì)胞合成PTH可能未受到影響。然而有研究使用大鼠甲狀旁腺提取的原代細(xì)胞分散培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠甲狀旁腺細(xì)胞GCM2 的mRNA及蛋白表達(dá)逐漸升高。這與本研究的結(jié)果不一致，可能是不同物種細(xì)胞在體外分子表達(dá)水平變化情況不一致，因?yàn)樗麄冄芯渴褂玫氖钦４笫螅狙芯渴褂玫氖荢HPT患者的樣本，GCM2本身已存在表達(dá)異常。

4）污水流速增大，換熱面積減小，當(dāng)污水流速為0.2 m/s時(shí)，換熱面積為472 m2，減小約19%；而提高到0.25 m/s時(shí)，換熱面積減小7%.三個(gè)速度中，0.2 m/s是較為適宜的設(shè)計(jì)速度.

既往研究顯示，隨著患者腎功能不全時(shí)間推移，SHPT病情進(jìn)展，患者甲狀旁腺?gòu)膹浡栽錾饾u進(jìn)展到腺瘤樣增生，甲狀旁腺細(xì)胞的CaSR表達(dá)也逐漸減少，在SHPT患者體內(nèi)甲狀旁腺細(xì)胞CaSR表達(dá)較正常人下調(diào)約60%。其確切機(jī)制尚未闡明，日本學(xué)者使用大鼠進(jìn)行5/6加高磷飲食進(jìn)行SHPT造模，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠的甲狀旁腺CaSR mRNA及蛋白表達(dá)均下降，且CaSR DNA甲基化程度較對(duì)照組更高，然而這種甲基化水平仍然很低（只有1%～2%），不足以解釋CaSR mRNA及細(xì)胞膜上CaSR蛋白表達(dá)下降，可能還有其他原因?qū)е耂HPT大鼠甲狀旁腺細(xì)胞CaSR的下調(diào)。有研究向大鼠腹膜內(nèi)注射1,25（OH）D后15 h，甲狀旁腺和腎臟的CaSR mRNA水平增加了2倍，表明在CaSR基因兩個(gè)啟動(dòng)子中均存在維生素D反應(yīng)元件，這一證據(jù)提示SHPT甲狀旁腺細(xì)胞膜CaSR的表達(dá)下降可能與體內(nèi)1,25（OH）D的減少有關(guān)。這與本研究的結(jié)果變化趨勢(shì)一致，P0代細(xì)胞傳代至P1代后細(xì)胞CaSR mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下降了，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

改進(jìn)后，依從性評(píng)分高于改進(jìn)前，8分率高于改進(jìn)前，0～5 分率低于改進(jìn)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

本實(shí)驗(yàn)中影響甲狀旁腺細(xì)胞原代培養(yǎng)成功與否的因素有：（1）樣本離體時(shí)間及組織塊的活性：離體后30 min內(nèi)處理的樣本，組織塊活性較高，細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿后貼壁良好，細(xì)胞貼壁后呈多角形或者紡錘形，細(xì)胞增殖均勻而緩慢，細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為71.61 h；（2）組織塊的大小：將樣本剪碎為0.5～1.0 mm組織塊時(shí)，利于用膠原酶法提取組織塊內(nèi)甲狀旁腺細(xì)胞，此時(shí)組織塊邊緣毛糙，利于細(xì)胞的游出；（3）無(wú)菌操作：嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的各項(xiàng)操作。

本研究采用膠原酶法成功分離了SHPT來(lái)源的甲狀旁腺細(xì)胞，細(xì)胞呈多角形或者紡錘形，細(xì)胞界限明顯，符合甲狀旁腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。此方法簡(jiǎn)便、高效，且獲得的細(xì)胞純度較高，具有良好的生物學(xué)特性?？稍隗w外培養(yǎng)P0、P1代甲狀旁腺原代細(xì)胞約14 d短期內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，達(dá)到探討SHPT分子機(jī)制的目的。