抑制TAK1可加重甲苯二異氰酸酯誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥

哮喘具有多種臨床表型和內(nèi)因型，大部分哮喘患者在吸入性糖皮質(zhì)激素等治療后可以有效控制，但仍有5%～20%的哮喘患者即使用高劑量吸入性糖皮質(zhì)激素治療仍控制不佳，這些重度哮喘或激素抵抗型哮喘的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。其中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的過度激活可能在激素抵抗過程發(fā)揮著重要作用。

本課題組長期關(guān)注甲苯二異氰酸酯（TDI）哮喘模型氣道炎癥發(fā)生機(jī)制，有研究發(fā)現(xiàn)，TDI誘導(dǎo)的是一種激素抵抗型哮喘模型，我們前期研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路在TDI哮喘模型明顯活化，且阻斷MAPK信號通路能有效減輕TDI哮喘小鼠的氣道炎癥、氣道屏障破壞及氣道高反應(yīng)性，提示MAPK通路可能與激素抵抗有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1）是激活下游包括NF-κB和MAPK信號通路活化的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞類型的炎癥、免疫和細(xì)胞死亡發(fā)揮關(guān)鍵作用，為治療炎癥性疾病的潛在靶點(diǎn)。有小樣本研究證實(shí)阻斷TAK1可以恢復(fù)激素抵抗哮喘患者來源的巨噬細(xì)胞對激素的敏感性。有文獻(xiàn)報(bào)道TAK1可能通過影響Th17通路在中性粒細(xì)胞哮喘免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。然而，TAK1是否在TDI誘導(dǎo)的激素抵抗型哮喘模型扮演重要角色及如何發(fā)揮作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討TAK1對TDI哮喘小鼠氣道炎癥的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑

丙酮、橄欖油、TDI（sigma）；TAK1 抑制劑5Z-7-Oxozeaenol（sigma），RIPK1抑制劑Necrostatin-1（MCE），CCK8（同仁），p-TAK1、TAK1、p-ERK、P38、p-P38、JNK、p-JNK、RIPK1、p-RIPK1 等一抗（CST），ERK 一抗（proteintech），Caspase8 一抗（proteintech），GADPH 一抗（proteintech），IRDye熒光二抗（licor），ELISA試劑盒（賽默飛），蘇木素染液，伊紅染液，凱基全蛋白提取試劑盒等。

1.2 TDI哮喘模型建立及動(dòng)物干預(yù)

SPF級雄性BALB/c小鼠64只（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），6～8周，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

對應(yīng)各部分新增傳感器等設(shè)備，一方面，對原PLC控制柜進(jìn)行改造，增加水冷系統(tǒng)等部分的數(shù)據(jù)采集和處理模塊；另一方面，對控制芯片進(jìn)行重新編程，拓展其監(jiān)測范圍和功能。其次，在柜體內(nèi)增加以太網(wǎng)模塊，保證PLC控制層與上機(jī)位的數(shù)據(jù)通信，從而為現(xiàn)場設(shè)備的遠(yuǎn)程監(jiān)控提供基礎(chǔ)。通過對PLC控制柜的改造，其主要結(jié)構(gòu)和功能如圖3，PLC芯片可對傳感器的數(shù)字和模擬信號進(jìn)行處理，并按照預(yù)定程序，向繼電器發(fā)出動(dòng)作信號，同時(shí)控制指示燈狀態(tài)。另外，及時(shí)將各種數(shù)據(jù)和處理結(jié)果經(jīng)由交換機(jī)傳輸至上機(jī)位。

TDI哮喘模型構(gòu)建：于造模第1、8天用0.3%TDI通過耳背皮膚致敏小鼠，第15、18、21天通過霧化吸入3%TDI激發(fā)小鼠，TDI溶于丙酮和橄欖油的混合物（AOO）中，空白對照小鼠只接受AOO致敏和激發(fā)，具體劑量參考先前研究。

與本研究抑制TAK1促炎作用相一致，在內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)的小鼠模型中，與野生型相比，TAK1敲除小鼠的肺部炎癥明顯加重，伴IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯增加，作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)p38和JNK激酶的磷酸化以及活性氧ROS水平明顯增加，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TAK1敲除小鼠來源的中性粒細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)明顯增加。提示TAK1在不同的模型中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。

TDI致敏及激發(fā)建立了以中性粒細(xì)胞為主的混合粒細(xì)胞性氣道炎癥的哮喘模型（圖2E），同時(shí)伴有氣道高反應(yīng)性及氣道重塑（圖2A，圖3D）。使用5Z-7-Oxozeaenol，進(jìn)一步加重了小鼠的氣道高反應(yīng)性及增加了血清IgE濃度（＜0.05，圖2A、B）。組織切片HE染色顯示，阻斷TAK1進(jìn)一步加重了氣道周圍炎癥細(xì)胞增多，上皮增生；進(jìn)一步評估小鼠氣道重塑指標(biāo)，結(jié)果顯示，TDI能顯著引起小鼠氣道粘液分泌的增加及上皮下膠原沉積（＜0.05，圖3D、E）。PAS 染色顯示，阻斷TAK1 對于粘液分泌沒有明顯影響（=0.850），MASSON染色則顯示其能明顯加重哮喘小鼠的膠原沉積（＜0.05）；而單獨(dú)使用TAK1抑制劑，對對照組的氣道炎癥（=0.147）、粘液分泌（=0.85）及膠原下沉積（=0.63）沒有明顯影響。

進(jìn)一步探討RIPK1在體內(nèi)模型的作用，將另外32只小鼠隨機(jī)分為4組，8只/組：AOO組，TDI組，TDI+5Z-7-Oxozeaenol組，TDI+5Z-7-Oxozeaenol+Necrostatin-1組。TDI+5Z-7-Oxozeaenol 組、TDI+5Z-7-Oxozeaenol+Necrostatin-1 組每次激發(fā)3 h 前腹腔注射5 mg/kg TAK1抑制劑（5Z-7-Oxozeaenol）和/或RIPK1活性抑制劑（Necrostatin-1,5 mg/kg），兩種抑制劑給藥時(shí)間間隔30 min。AOO組、TDI組給予同等劑量的DMSO。

Western blotting結(jié)果顯示，TDI-HSA刺激與TDIHSA聯(lián)合TAK1抑制劑共同處理，未能明顯影響RIPK1蛋白水平，而TDI-HSA 聯(lián)合TAK1 抑制劑，在2 h 時(shí)RIPK1磷酸化水平上升（＜0.05），隨后降低。單獨(dú)使用TDI-HSA 刺激RAW264.7，Caspase 8 在2 h 出現(xiàn)活化（＜0.05），隨后快速降低，而TDI-HSA聯(lián)合TAK1抑制劑，其Caspase 8活性明顯升高，且隨后進(jìn)一步升高（＜0.05）。進(jìn)一步使用RIPK1活性抑制劑Necrostatin-1，明顯恢復(fù)TDI-HSA聯(lián)合TAK1抑制劑引起的細(xì)胞活力的下降（＜0.05），而對于單獨(dú)TAK1抑制劑引起的細(xì)胞活力水平的下降沒有明顯影響（=0.48）。

金葉風(fēng)箱果為薔薇科風(fēng)箱果屬落葉灌木，高可達(dá)3 m，株型呈拱形多分枝，小枝光滑無毛，冠形開展。原產(chǎn)北美，在我國大連、北京、重慶等多個(gè)城市廣泛栽培。金葉風(fēng)箱果整個(gè)生長季新梢1～8片葉一直是金黃色。葉片春季和初夏金黃色，中夏至秋季黃綠色，秋末葉呈黃紅相間色[1]。夏季花序密集，花色淡雅，入秋果實(shí)變紅,可用于綠籬、假山旁、路旁、海岸種植，是優(yōu)良的觀葉、觀花、觀果植物[2]。但其優(yōu)良性狀在生產(chǎn)上一般通過扦插繁殖得以保持下來，為了給培育優(yōu)質(zhì)壯苗提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)行了金葉風(fēng)箱果的扦插繁殖試驗(yàn)。

1.3 RAW264.7培養(yǎng)，刺激及細(xì)胞活力檢測。

小鼠單核巨噬細(xì)胞株（RAW264.7，中科院），其采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，予不含血清的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞12 h，即饑餓處理后，予不同濃度5Z-7-Oxozeaenol、1 μmol/L Necrostatin-1 及80 μg/mL TDI-HSA刺激細(xì)胞一定時(shí)間，TDI-HSA復(fù)合物按文獻(xiàn)配置。細(xì)胞活力依照CCK8試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.5 Western blot

采用凱基全蛋白提取試劑盒抽提細(xì)胞總蛋白，肺組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，使用BIO-RAD進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，一抗4 ℃過夜，TBST洗膜30 min，二抗孵育1 h，LI-COR紅外熒光掃描成像檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

TDI哮喘小鼠Th2/Th17炎癥因子升高（＜0.05，圖3A、B），給予TAK1抑制劑增加了IL-4及IL-13水平（＜0.05），而IL-5差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.21）。阻斷TAK1升高了TDI哮喘小鼠淋巴上清IL-17F的水平（＜0.05），降低了TDI引起IL-17A的水平的升高（＜0.05）。同時(shí)，單純的TDI致敏及激發(fā)組，未能在BALF中檢測到IL-1β，而給予TAK1抑制劑，檢測到IL-1β升高（＜0.05，圖3C）。

2 結(jié)果

2.1 TAK1抑制劑降低TDI誘導(dǎo)的TAK1磷酸化水平的升高及MAPK信號通路的活化

結(jié)果顯示，阻斷TAK1不僅降低了TDI引起的肺組織TAK1磷酸化水平的升高，同時(shí)降低了其下游分子P38 MAPK，JNK及ERK的磷酸化水平（＜0.05，圖1）。

2.2 阻斷TAK1進(jìn)一步加重了TDI誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性及氣道炎癥

取pH=6.0的枸杞蛋白質(zhì)溶液8.0ml，加入相對應(yīng)的(NH4)2SO4固體[11]，使蛋白質(zhì)溶液的(NH4)2SO4飽和度達(dá)20%，搖勻，靜置3～4h后以8000r/min離心10min，傾出上清液并測量體積，重復(fù)以上步驟，直到蛋白質(zhì)溶液的(NH4)2SO4飽和度達(dá)100%。得到(NH4)2SO4飽和度分別為20%、40%、60%、80%、100%的枸杞蛋白沉淀。向5次離心后的傾出上清液的離心管中加入0.2mol/l pH=6.0的PBS緩沖液5.0ml，輕輕搖動(dòng)，使貼于管壁上的蛋白質(zhì)溶解后置于冰箱中保存。

2.3 阻斷TAK1增加TDI哮喘小鼠淋巴上清Th2/Th17炎癥水平

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析；符合方差齊性檢驗(yàn)者，組內(nèi)比較使用LSD方法檢驗(yàn)，不符合方差齊性檢驗(yàn)者，組內(nèi)比較使用Dunnett's T3分析，＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

觀察組組織中COX-2和VEGF表達(dá)的陽性率均顯著高于對照組（P＜0.001），LMP1的陽性率明顯低于對照組（P＜0.001），另外觀察組血清中IL-8的表達(dá)水平較對照組明顯增高（P＜0.001），見表1。

2.4 TDI-HSA 聯(lián)合TAK1 抑制劑對巨噬細(xì)胞RAW264.7活力的影響

TAK1抑制劑可以降低TDI哮喘小鼠肺泡灌洗液（BALF）分類計(jì)數(shù)細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的比值（圖2D）。單獨(dú)使用TDI-HSA（80 μg/mL）刺激細(xì)胞，未降低細(xì)胞活力（圖4）。而單獨(dú)使用TAK1抑制劑，可以在較高濃度時(shí)（5000 nmol/L）時(shí)，在早期（2 h）時(shí)細(xì)胞活力降低（＜0.05），而較低濃度（500 nmol/L）時(shí)到6 h時(shí)細(xì)胞活力出現(xiàn)降低（＜0.05）。同時(shí)，與單獨(dú)使用TAK1 抑制劑相比，與TDI-HSA 聯(lián)合使用降低了細(xì)胞活力（＜0.05）。為探討抑制TAK1加重TDI誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道炎癥的機(jī)制，以下實(shí)驗(yàn)中，選用500 nmol/L的抑制劑濃度處理細(xì)胞。

2.5 TAK1抑制劑對TDI-HSA誘導(dǎo)的RAW264.7 TAK1磷酸化水平的影響

本研究首次發(fā)現(xiàn)在TDI哮喘模型中，抑制TAK1進(jìn)一步加重了TDI哮喘小鼠的氣道炎癥，其機(jī)制可能與促進(jìn)巨噬細(xì)胞RIPK1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡有關(guān)。有研究報(bào)道，在小鼠顆粒物誘導(dǎo)的原代巨噬細(xì)胞模型中，敲除TAK1可以降低IL-6、IL-33的表達(dá)，與野生組型比，肺巨噬細(xì)胞TAK1條件敲除小鼠肺部炎癥指標(biāo)及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)明顯降低。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn)P38 MAPK、JNK、ERK等MAPK信號通路在TDI哮喘模型中明顯活化，阻斷JNK 能明顯減輕氣道炎癥。TAK1作為MAPK信號通路的上游激酶，因此，我們設(shè)想TDI 哮喘小鼠的氣道炎癥能被TAK1 抑制劑所減輕。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAK1抑制劑確實(shí)可以顯著抑制TDI誘導(dǎo)的MAPK信號通路的活化。然而，非常有趣的是，TAK1抑制劑卻進(jìn)一步加重了TDI哮喘小鼠的氣道炎癥，上皮的脫落，氣道的高反應(yīng)性。這提示，TDI哮喘模型中，TAK1抑制劑加重哮喘氣道炎癥并不是通過促進(jìn)下游的MAPK信號通路活化而發(fā)生。

2.6 TAK1抑制劑對TDI-HSA誘導(dǎo)的MAPK信號通路活化的影響

TDI-HSA 刺激RAW264.7 細(xì)胞，5 min 即引起p-P38、p-JNK 及p-ERK 等蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.05）。而給予TAK1 抑制劑與TDI-HSA 共同處理RAW264.7、JNK、P38及ERK蛋白的磷酸化水平都降低（＜0.05）。

2.7 阻斷TAK1促進(jìn)了RIPK1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡

按照上述方法造模后，于第22天檢測氣道反應(yīng)性后，處死小鼠，取右肺進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)脫蠟至水進(jìn)行HE染色、PAS染色及MASSON染色。氣道反應(yīng)性及淋巴細(xì)胞培養(yǎng)詳見文獻(xiàn)［12］。

2.8 使用RIPK1抑制劑可以恢復(fù)TAK1抑制劑引起的TDI哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的加重

與單獨(dú)使用TAK1抑制劑對TDI哮喘小鼠相比，聯(lián)合使用RIPK1 活性抑制劑可減輕氣道炎癥（＜0.05，圖7），降低血清IgE濃度及淋巴上清中IL-4、IL-13及IL-17F水平及改善氣道重塑（＜0.05）。

渡槽為現(xiàn)澆肋拱模架，盤扣模架底座搭設(shè)在橫橋向工字鋼上；盤扣支架的橫向剪刀撐應(yīng)與支架底部橫向工字鋼進(jìn)行焊接，將工字鋼、貝雷梁與鋼支墩之間用套箍進(jìn)行連接；下部鋼管柱采用鋼筋混凝土條形基礎(chǔ)，并預(yù)埋鋼板埋件。

3 討論

檢測各組間TAK1水平及其磷酸化程度顯示，單獨(dú)TDI-HSA刺激RAW264.7后，TAK1的磷酸化水平在短時(shí)間內(nèi)即升高（＜0.05，圖5）。而使用TAK1抑制劑5Z-7-Oxozeaenol（500 nmol/L），可以降低TDI-HSA引起的TAK1磷酸化水平的升高（＜0.05）。

為探討TAK1在TDI哮喘模型中的作用，將32只小鼠隨機(jī)分為4 組，8 只/組：AOO 組，AOO+5Z-7-Oxozeaenol 組，TDI 組，TDI+5Z-7-Oxozeaenol 組。AOO+5Z-7-Oxozeaenol 組、TDI+5Z-7-Oxozeaenol 組于每次激發(fā)3 h前腹腔注射5 mg/kg TAK1抑制劑（5Z-7-Oxozeaenol）干預(yù)TAK1，AOO組、TDI組給予同等劑量的DMSO。

巨噬細(xì)胞是肺部最重要的免疫細(xì)胞之一，在變應(yīng)原誘發(fā)的哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，巨噬細(xì)胞可以通過分泌多種炎癥介質(zhì)，包括IL-1β、IL-33、TNF-α等在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，亦有研究發(fā)現(xiàn)，TDI哮喘中巨噬細(xì)胞活化。因此，本研究假設(shè)在TDI哮喘模型中，TAK1抑制劑通過增加巨噬細(xì)胞的死亡，釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重TDI哮喘小鼠的氣道炎癥。與預(yù)期一致，本研究顯示抑制TAK1后明顯降低哮喘模型BALF中巨噬細(xì)胞比例，體外亦降低RAW264.7細(xì)胞活力，且在與TDI-HSA共同刺激時(shí)其細(xì)胞活力進(jìn)一步下降，但其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

TAK1作為MAPK與NF-κB信號通路的上游激酶，通常參與促生存信號，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)其被抑制或缺失時(shí)，細(xì)胞將發(fā)生PANoptosis，細(xì)胞從促生存信號向促死亡信號方向轉(zhuǎn)變。PANoptosis包括焦亡、凋亡和壞死三種細(xì)胞死亡形式，是由含有RIPK1、ASC和caspase 8的PANoptosome的形成觸發(fā)的，其中RIPK1激酶活性對驅(qū)動(dòng)焦亡、凋亡和壞死混合細(xì)胞死亡表型至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用TAK1抑制劑及TDI-HSA 可以激活RIPK1 的活性，同時(shí)持續(xù)裂解Caspase 8，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的死亡，使用RIPK1抑制劑可以降低RAW264.7的死亡，同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)使用RIPK1抑制劑可以顯著減輕TAK1抑制劑對于TDI哮喘小鼠氣道炎癥的加重。與本研究一致，近期有研究發(fā)現(xiàn)，衰老導(dǎo)致TAK1表達(dá)減少會導(dǎo)致RIPK1驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)退行性變。有研究提出耶爾森氏菌誘導(dǎo)細(xì)胞死亡模型，即部分巨噬細(xì)胞被耶爾森菌感染，當(dāng)宿主細(xì)胞感知到TAK1被抑制時(shí)，形成由RIPK1、Caspase 8和FADD組成的細(xì)胞死亡復(fù)合體，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加和隨后的細(xì)胞死亡，釋放IL-1β，K+等，激活部分TAK1未被抑制的巨噬細(xì)胞，以促發(fā)更為迅速的炎癥瀑布反應(yīng)。本研究設(shè)想在TDI哮喘模型中，TAK1磷酸化水平的增高，抑制了RIPK1活性，進(jìn)而限制了Caspase 8的持續(xù)活化，從而降低了巨噬細(xì)胞的死亡。然而，在TAK1抑制劑處理的哮喘模型中，是否也發(fā)生了PANoptosis，其細(xì)胞死亡是否也為包括焦亡、凋亡和壞死多種細(xì)胞死亡形式的混合細(xì)胞死亡表型，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

心電圖作圖是一項(xiàng)比較簡單的操作，但日常工作中有可能忙中出錯(cuò)，大批量體檢、心電遠(yuǎn)程會診中，讀圖者與作圖者分離，讀圖者無法了解作圖時(shí)的導(dǎo)聯(lián)連接情況，即使初步判斷有可能發(fā)生導(dǎo)聯(lián)錯(cuò)接，也需要重新作圖方能驗(yàn)證，并出具正確的報(bào)告，以便臨床下一步診治。實(shí)際情況是，患者若了解是由于作圖者的失誤而要求自已再來診室重新作圖，其理解及配合度不會很高。利用本文中導(dǎo)聯(lián)錯(cuò)接的判斷及調(diào)整方法能實(shí)現(xiàn)“一鍵還原”，既不麻煩患者，也不影響診斷的效果，值得臨床推廣。

本研究發(fā)現(xiàn)，與其他炎癥性疾病不同，抑制TAK1出乎意料地加重了TDI哮喘小鼠的氣道炎癥，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其對于巨噬細(xì)胞死亡的影響。在不同細(xì)胞死亡途徑之間存在著許多的聯(lián)系，在特定刺激下，參與細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和/或壞死的分子可以同時(shí)被激活。未來對細(xì)胞死亡之間各種聯(lián)系和調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究，將進(jìn)一步幫助理解其中的作用途徑。

綜上所述，在TDI哮喘小鼠模型中，TAK1阻斷進(jìn)一步加重了氣道炎癥，其機(jī)制可能與促進(jìn)RIPK1信號通路及Caspase 8的持續(xù)活化，從而促發(fā)巨噬細(xì)胞的持續(xù)死亡，增加炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)。

由于對排風(fēng)冷量進(jìn)行了回收對新風(fēng)進(jìn)行預(yù)冷，同時(shí)采用排風(fēng)蒸發(fā)冷卻技術(shù)降低了制冷系統(tǒng)的冷凝壓力，提升了雙冷源新風(fēng)機(jī)組的制冷效率，制冷性能系數(shù)和除濕性能系數(shù)都比常規(guī)冷凍除濕有了顯著提高。