消積通便方對便秘小鼠VIP-cAMP-PKA信號通路的影響

胡 鈺，候淑婷

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；3. 江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點實驗室，江蘇 南京 210023)

功能性便秘是兒科常見疾病。Walter等[1]報道斯里蘭卡6.5個月～4歲兒童功能性便秘的發(fā)病率為8%，陳凌華等[2]報道南充地區(qū)0～4歲嬰幼兒功能性便秘的發(fā)病率為6.2%。白鉑亮等[3]綜述分析小兒便秘發(fā)生率為0.13%～8%，占兒科門診患兒的3%～5%。功能性便秘的發(fā)病原因及發(fā)病機制尚不明確，多歸結(jié)于胃腸動力異常、排便習(xí)慣不良、飲食結(jié)構(gòu)不合理等。消積通便方取義于小承氣湯，全方由枳實、厚樸、連翹、雞內(nèi)金、六神曲、炒決明子、天花粉、胡黃連組成，具有消積導(dǎo)滯、瀉熱潤腸的功效，前期研究顯示該方治療便秘療效較好[4]，但其治療便秘的具體機制尚不明確。血管活性腸肽(VIP)和一氧化氮(NO)屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可減緩腸道蠕動，參與便秘的發(fā)生發(fā)展。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)與炎癥反應(yīng)有關(guān)，其可在相當(dāng)長時間內(nèi)穩(wěn)定合成大量的NO。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)存在于細胞內(nèi)，通過與cAMP依賴性的蛋白激酶A(PKA)的結(jié)合亞基結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞功能活動，發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)[5-6]。目前研究認為VIP發(fā)揮作用與cAMP-PKA信號通路有關(guān)[7]。因此，本實驗基于VIP-cAMP-PKA信號通路，探討了消積通便方治療便秘的可能機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性ICR小鼠64只，體重25～28 g，購于杭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK(浙)2019-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～24 ℃，相對濕度40%～60%，晝夜節(jié)律12 h/12 h。60Co輻照實驗鼠維持飼料，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。適應(yīng)性飼養(yǎng)期間模擬捕捉小鼠，每天1次。本實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審核通過(202010A020)。

1.2實驗藥物 消積通便方組方：枳實12 g、厚樸10 g、連翹10 g、雞內(nèi)金10 g、六神曲10 g、炒決明子10 g、天花粉3 g、胡黃連1 g，藥材購于南通市中醫(yī)院，由重慶三峽學(xué)院三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室周濃教授鑒定為合格藥材。煎煮方法：加8倍中藥量冷水，在鍋內(nèi)浸泡約30 min，大火煎藥，待沸騰后文火煎煮30 min后過濾藥液；二煎時加6倍量水煎30 min，過濾后將2次藥液混合，旋蒸至含生藥3 g/mL的溶液，密封于無菌量瓶，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。藥物制備符?020版《中華人民共和國藥典(一部)》項下相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)定。鹽酸洛哌丁胺(西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H0910085)、枸櫞酸莫沙必利膠囊(上海新黃河制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20173152)購自南通市中醫(yī)院。給藥劑量根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[8]實驗動物與人體臨床用藥劑量轉(zhuǎn)換公式 (dB是欲求算的B種動物的千克體重劑量、dA是已知A種動物的千克體重劑量；WA和WB是已知動物A，B的體重；RB和RA是A，B動物的體型系數(shù))計算。消積通便方等效劑量即中劑量濃度約為18 g/mL，高劑量組濃度為36 g/mL，低劑量濃度為9 g/mL。洛哌丁胺、莫沙必利等效劑量藥物濃度約為10 mg/kg。

1.3試劑和儀器 印度墨水(L17S11G124902，上海源葉生物科技有限公司)；小鼠VIP ELISA試劑盒(JEB-12692，全式金生物科技)；小鼠iNOS ELISA試劑盒(JEB-12704，全式金生物科技)；TRIzol RNA分離試劑(10296028，Thermo scientific公司)；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(M20427，全式金公司)；AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(7E082G6，諾維贊公司)；Mouse GAPDH Endogenous Reference Genes Primers,100 μM(B662304-0001，上海生工)。Light cycle 96，混合冷凍混合球磨儀M4M400(德國Retsch公司)；Millipore Synergy型超純水系統(tǒng)(德國Merc公司)；Allegra 64R型離心機(美國Beckman Coulter公司)；AF103制冰機(美國Scotsman公司)；BS224型電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Lightcycle 96 realtime-PCR檢測儀(羅氏公司)；TaKaRa Thermal Cycler PCR儀(TaKaRa公司)。

1.4實驗方法 將64只SPF級雄性ICR小鼠隨機分為空白組、模型組、消積通便方低劑量組、消積通便方中劑量組、消積通便方高劑量組、莫沙必利組，每組14只。適應(yīng)性飼養(yǎng)后，空白組給予0.2 mL/10 g體重生理鹽水灌胃，其余各組給予洛哌丁胺10 mg/kg灌胃，均2次/d，共14 d。于實驗過程中的第8天開始，消積通便方低、中、高劑量組分別給予9 g/mL、18 g/mL、36 g/mL消積通便方藥液灌胃，莫沙必利組給予10 mg/kg莫沙必利灌胃，正常組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃，灌胃量均為0.2 mL/10 g體重，1次/d，連續(xù)7 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1一般狀態(tài) 實驗過程中觀察各組小鼠毛色、反應(yīng)靈敏度、精神狀態(tài)、進食飲水情況、體重等。

1.5.2胃排空率和腸道推進率 各組小鼠于末次灌胃后禁食16 h，自由飲水。每組隨機選取6只小鼠灌胃印度墨水，并計時20 min，然后予2%異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉，用頸椎脫臼法處死小鼠，眼底靜脈取血后迅速摘除并結(jié)扎胃賁門和幽門，取出胃，稱量全胃重量，然后沿胃大彎處將胃剖開，PBS液中洗去胃內(nèi)容物，用濾紙將胃水分吸凈，稱量空胃重，計算胃排空率[(全胃重-空胃重)/全胃重×100%]。同時迅速取出小腸，無張力拉直后測量印度墨水推進長度(L2)，并測量從幽門至盲腸的小腸長度(L1)，計算小鼠腸道推進率(L2/L1×100%)。

1.5.3血清VIP和iNOS水平檢測 眼底靜脈血在室溫條件下自然凝固10～20 min,再以3 000 r/min離心20 min左右，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法，按照試劑盒說明書檢測血清VIP和iNOS水平。

1.5.4結(jié)腸組織HE染色觀察 取出結(jié)腸后剪取距結(jié)腸遠端10 mm左右的結(jié)腸8～10 mm，將結(jié)腸組織放入4%多聚甲醛液中固定24 h以上，然后將結(jié)腸組織進行石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，100倍顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜上皮的完整情況。

1.5.5結(jié)腸組織中PKA和cAMP mRNA表達檢測采用RT-PCR法檢測：取出-80 ℃保存結(jié)腸組織，采用RNA提取試劑盒TRIzol法提取RNA，抽提后稀釋RNA，并檢測其OD 260/OD 280的比值，比值在1.8～2.2之間即為正常。反轉(zhuǎn)錄cDNA：按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書操作，合成cDNA，基因組DNA清除條件：42 ℃，2 min；Store at 4 ℃；反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃，15 min；85 ℃，5 s；Store at 4 ℃。將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA產(chǎn)物用RNase-free Water稀釋10倍后作為模板，配制各組的PCR反應(yīng)體系(20 μL)，GAPDH作為內(nèi)參，加樣完畢后，使用realtime定量PCR儀檢測。引物序列：PKA上游引物為5’-CAACAACCGAGTGTGCTTGAT-3’，下游引物為5’-TCATTTGCGATCCGAGTCTGG-3’；cAMP上游引物為5’-GAGCAAGGAACGAGTTACAAAGC-3’；下游引物為5’-TGGACTGTTTCAACGCATCCC-3’。定量PCR條件：95.0 ℃，2 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。72.0 ℃，30 s獲取熒光值。95.0 ℃ 15 s，60.0 ℃ 1 min，95.0 ℃ 15 s，60 s退火。記錄CT值，根據(jù)文獻[9]，采用2-ΔΔCT法計算PKA和cAMP mRNA相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般狀態(tài) 實驗過程中，空白組小鼠毛色光亮，反應(yīng)靈敏，精神狀態(tài)良好，進食、飲水正常，體重逐步增加。模型組小鼠有不同程度易激惹或倦怠，精神不振，反應(yīng)遲鈍，進食量及飲水量減少，體重增長幅度較小。消積通便方各組及莫沙必利組小鼠精神狀態(tài)及活動好于模型組，毛色轉(zhuǎn)為光亮順滑，進食、飲水量漸增，體重增長幅度明顯大于模型組小鼠。

2.2各組小鼠胃排空率和腸道推進率比較 與空白組比較，模型組小鼠胃排空率明顯增高(P<0.05)，腸道推進率明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，消積通便方各組及莫沙必利組小鼠胃排空率均明顯降低(P均<0.05)，消積通便方中、高劑量組及莫沙必利組小鼠腸道推進率均明顯增高(P均<0.05)，消積通便方低劑量組小鼠腸道推進率無明顯變化(P>0.05)。見圖1。

C為正常組；M為模型組；Z1為消積通便方低劑量組；Z2為消積通便方中劑量組；Z3為消積通便方高劑量組；P為莫沙必利組圖1 空白組和便秘各組小鼠胃排空率和腸道推進率

2.3各組小鼠血清VIP、iNOS水平比較 與空白組比較，模型組小鼠血清VIP、iNOS水平均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，消積通便方各組及莫沙必利組小鼠血清VIP、iNOS水平均明顯降低(P均<0.05)。見圖2。

C為正常組；M為模型組；Z1為消積通便方低劑量組；Z2為消積通便方中劑量組；Z3為消積通便方高劑量組；P為莫沙必利組圖2 空白組和便秘各組小鼠血清 VIP、iNOS水平

2.4各組小鼠結(jié)腸組織HE染色情況 HE染色見模型組小鼠結(jié)腸組織黏膜層部分缺失，固有層及黏膜下層可見炎性細胞浸潤聚集，肌層明顯變?。幌e通便方各組及莫沙必利組小鼠結(jié)腸組織黏膜層上皮細胞破損、缺失及固有層、黏膜下層炎性細胞浸潤、肌層變薄等情況明顯減輕，以消積通便方中、高劑量組改善明顯。見圖3。

圖3 空白組和便秘各組小鼠結(jié)腸組織HE染色表現(xiàn)(×100)

2.5各組小鼠結(jié)腸組織中PKA和cAMP mRNA表達量比較 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中PKA和cAMP mRNA表達量均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，消積通便方高劑量組及莫沙比利組小鼠結(jié)腸組織中PKA和cAMP mRNA表達量均明顯增高(P均<0.05)，消積通便方低、中劑量組變化不明顯(P均>0.05)。見圖4。

C為正常組；M為模型組；Z1為消積通便方低劑量組；Z2為消積通便方中劑量組；Z3為消積通便方高劑量組；P為莫沙必利組圖4 空白組和便秘各組小鼠結(jié)腸組織中PKA和cAMP mRNA相對表達量

3 討 論

隨著現(xiàn)代社會飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，功能性胃腸道疾病如便秘的發(fā)病率不斷增高[10]。Saps等[11]應(yīng)用羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)評估拉丁美洲3 567名8～18歲兒童功能性胃腸道疾病的患病率為21.2%，其中排便障礙的比例為10.7%。相關(guān)研究顯示，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)VIP可以松弛胃腸道平滑肌，抑制胃腸蠕動，降低胃腸道黏膜的分泌功能[12]。NO可舒張腸道平滑肌，減緩腸道運動[13]。VIP常與NO協(xié)同發(fā)揮抑制胃腸道的作用而引發(fā)便秘[14]。

中醫(yī)認為小兒脾常不足，長期乳食過量，積滯蘊于胃腸，阻礙脾胃氣機升降，腸腑糟粕難以排出而發(fā)生便秘。在臨床診療中，食積內(nèi)熱型便秘發(fā)生率約占45.16%[15]。趙霞等[4]運用導(dǎo)滯潤腸瀉熱之消積通便方治療小兒食積內(nèi)熱證便秘療效滿意。消積通便方中枳實、厚樸為君藥，枳實味苦、辛，性微寒，功能破氣消積、化痰除痞，有調(diào)節(jié)VIP分泌，增強小腸傳導(dǎo)動力的作用[16-17]；厚樸味苦、辛，性溫，其下氣消積之功與調(diào)節(jié)NO的分泌，促進胃部蠕動有關(guān)[18]。臣藥連翹清熱解毒、消腫散結(jié)，具有調(diào)節(jié)胃腸激素分泌，雙向調(diào)節(jié)胃腸動力的作用[19]；臣藥炒決明子清肝明目、潤腸通便，能夠改善小鼠結(jié)腸運動功能[20]。佐以天花粉清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿，六神曲、雞內(nèi)金健脾和胃、消積導(dǎo)滯，胡黃連清導(dǎo)腸道濕滯。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠胃排空率及血清VIP、iNOS水平均明顯增高，腸道推進率明顯降低，HE染色顯示結(jié)腸黏膜固有層及黏膜下層可見炎性細胞浸潤；與模型組比較，消積通便方中、高劑量組及莫沙必利組小鼠胃排空率及血清VIP、iNOS水平均明顯降低，消積通便方高劑量組和莫沙必利組小鼠腸道推進率均明顯升高，HE染色顯示消積通便方中、高劑量組及莫沙必利組小鼠結(jié)腸組織損傷明顯減輕。推測消積通便方治療便秘的機制與調(diào)節(jié)胃腸道神經(jīng)遞質(zhì)的分泌水平有關(guān)。

cAMP為細胞內(nèi)第二信使，當(dāng)細胞外第一信使含氮激素的信息傳遞到細胞內(nèi)后，cAMP通過與cAMP 依賴性的PKA結(jié)合亞基結(jié)合轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細胞的功能活動[5-6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，VIP和胃腸道平滑肌細胞表面的特異性VIP受體結(jié)合后，將信號傳遞至胃腸道平滑肌細胞內(nèi)，激活cAMP-PKA信號通路，使得Ca2+內(nèi)流相應(yīng)減少，胃腸道平滑肌舒張，導(dǎo)致便秘的發(fā)生[21-22]。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸組織中PKA mRNA、cAMP mRNA表達量均較空白組明顯降低，消積通便方高劑量組和莫沙必利組小鼠結(jié)腸組織中PKA mRNA、cAMP mRNA表達量均較模型組明顯增高。提示消積通便方可以激活cAMP-PKA通路。

綜上所述，消積通便方可能通過下調(diào)VIP、iNOS水平及激活cAMP-PKA通路，從而調(diào)節(jié)腸道平滑肌的活動，促進腸道蠕動，修復(fù)受損的結(jié)腸組織黏膜，緩解便秘癥狀。但是消積通便方治療便秘的分子機制還不清楚，有待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。