長(zhǎng)期ART中HIV-1抗體存在的水平變化特點(diǎn)及其與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)相關(guān)關(guān)系的研究

張 晴，高 林，郭曉燕，孜來(lái)古麗·米吉提，郭云天，CHEN Wei-wei，焦艷梅，王福生

HIV-1是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒，在沒(méi)有接受任何治療的情況下，對(duì)免疫系統(tǒng)中的CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行大量破壞[1]。截至2020年底，全球有3770萬(wàn)人感染了HIV-1，其中150萬(wàn)人為新發(fā)感染者，約有68萬(wàn)人死于AIDS相關(guān)疾病[2]。隨著抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（antiretroviral therapy, ART）的推廣，HIV-1感染者的病毒載量得到了有效控制，但由于HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)的存在，ART停止后病毒載量會(huì)出現(xiàn)反彈[3]。因此，HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)是AIDS功能性治愈的最大障礙，HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)的定量檢測(cè)對(duì)評(píng)估HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)的大小至關(guān)重要。

目前檢測(cè)HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小的方法有定量病毒生長(zhǎng)試驗(yàn)、Alu-gag PCR和tat/rev誘導(dǎo)的有限稀釋法等[4]，但以上方法操作復(fù)雜且檢測(cè)結(jié)果存在爭(zhēng)議[5-6]。所以研究者試圖探索出一種新的方法來(lái)檢測(cè)HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小。目前已有多項(xiàng)研究報(bào)道了HIV-1抗體水平與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小有關(guān)聯(lián)[7-9]。HIV-1特異性抗體是由HIV-1刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類(lèi)免疫球蛋白，主要包括結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)控蛋白和輔助蛋白[10]。以上HIV-1特異性抗體發(fā)揮作用不同，且不同抗體水平與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小的關(guān)系尚未明確。另有研究表明p24抗體水平與HIV-1感染者的臨床狀態(tài)有關(guān)，是較好的隨訪檢測(cè)標(biāo)志物[11]，關(guān)于p24抗體水平和HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小的關(guān)系值得探討。

目前評(píng)估HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小最常用的指標(biāo)是總HIV-1 DNA和細(xì)胞相關(guān)RNA（cell-associated RNA, CA-RNA）[12-13]，本研究納入接受ART 5年的HIV-1感染者，檢測(cè)患者的p24抗體、總HIV-1特異性抗體、總HIV-1 DNA和CA-RNA水平，探討長(zhǎng)期ART患者的p24抗體和總HIV-1特異性抗體水平及其與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2009年11月—2013年7月于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心接受ART的147例HIV-1感染者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HIV-1/AIDS診斷參照《中國(guó)艾滋病診療指南（2018版）》[14]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)ART滿(mǎn)5年；③ART6個(gè)月內(nèi)患者HIV-1 RNA降至檢測(cè)下限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床信息不完整；②妊娠期婦女；③合并其他病毒感染（如HBV、HCV等）；④有HIV-1相關(guān)機(jī)會(huì)性感染；⑤死亡患者。排除不符合條件的感染者，最終有27例HIV-1感染者納入本研究。本研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有入組患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 用EDTA-K2真空采血管采集入組對(duì)象的靜脈血2 ml、5 ml，其中2 ml管用于CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)定；5 ml管離心10 min后，上層血漿用于病毒載量的檢測(cè)，余下的細(xì)胞采用密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）。

1.2.2 全血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 移取50 μl HIV-1感染者的EDTA抗凝全血置于絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，加入20 μl CD3/CD4/CD8/CD45的組合抗體（美國(guó)BD公司），震蕩混勻后于室溫下避光孵育25 min，然后加入450 μl溶血素（美國(guó)BD公司），混勻后繼續(xù)室溫孵育20 min，孵育結(jié)束后使用FACS Calibur型流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)，并進(jìn)行CD4/CD8比值的計(jì)算。

1.2.3 血漿HIV-1 RNA病毒載量檢測(cè) 使用NPA-32P核酸純化儀（杭州博日公司）先提取樣本的RNA，然后使用HIV-1套式反轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)試劑盒（杭州博日公司）在CFX96TM Real-Time system型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀（美國(guó)BIO-RAD公司）上檢測(cè)樣本血漿中HIV-1 RNA，檢測(cè)范圍是80拷貝 /ml～ 1.8×108拷貝 /ml。

1.2.4 總HIV-1特異性抗體檢測(cè) 根據(jù)HIV-1抗體診斷試劑盒（萬(wàn)泰生物，北京）說(shuō)明書(shū)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)總HIV-1特異性抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，在450 nm波長(zhǎng)處，使用酶標(biāo)儀讀取不同孔的吸光度（OD）值，用OD值表示總HIV-1特異性抗體水平。

1.2.5 p24抗體定量檢測(cè) 采用熒光素酶免疫吸附試驗(yàn)對(duì)p24抗體進(jìn)行定量檢測(cè)[15]：使用磷酸鹽緩沖液（濃度0.01 mol/L，pH7.5）將G蛋白（Genscript，中國(guó)）稀釋成5 μg/ml后，包被在96孔白色微孔板（Corning，美國(guó)）上，并在4 ℃下孵育12 h；然后用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗板后加入5%的脫脂牛奶，在37 ℃下封閉1 h；洗滌后每孔加入100 μl的血清樣品（2%脫脂牛奶1∶100稀釋?zhuān)?，并?7℃下孵育1 h；再次洗滌后每孔加入50 μl熒光素p24抗原裂解上清液（2%脫脂牛奶1:1000稀釋?zhuān)?，并?7 ℃下孵育30 min。最后每孔加入50 μl的Nano-Glo熒光素酶檢測(cè)試劑，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)讀取熒光值（LU）。

1.2.6 總HIV-1 DNA和CA-RNA的定量檢測(cè) 用QIAamp DNA Mini 試劑盒（Qiagen，德國(guó)）和HiPure Total RNA Plus Mini 試劑盒（Magen，中國(guó)廣州）分別從PBMCs中提取細(xì)胞中總的DNA和RNA。用HIV-1 DNA定量檢測(cè)試劑盒（SUPBIO，中國(guó)廣州）和CA-RNA定量檢測(cè)試劑盒（SUPBIO，中國(guó)廣州）分別定量檢測(cè)總HIV-1 DNA和CARNA。定量范圍是10拷貝/106PBMC～5×106拷貝/106PBMC，檢測(cè)結(jié)果以對(duì)數(shù)形式表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。計(jì)量資料根據(jù)需要采用±s或四分位數(shù)表示。各時(shí)間點(diǎn)與基線比較采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本信息 27例患者中，男性26例，女性1例，HIV-1感染者開(kāi)始接受ART時(shí)的年齡是（39.8±11.91）歲。接受3TC+NVP+AZT治療的患者14例，接受3TC+AZT+EFV治療的患者7例，接受3TC+EFV+TDF治療的患者5例，接受3TC+NVP+TDF治療的患者1例。詳見(jiàn)表 1。

表1 27例患者基本信息Table 1 Basic information of 27 patients

2.2 長(zhǎng)期ART過(guò)程中總HIV-1特異性抗體、p24抗體、總HIV-1 DNA和CA-RNA水平的變化 27例HIV-1感染者在ART 0、1、3、5年時(shí)p24抗體水平分別為2.450（1.910～5.460）、1.460（1.080～2.160）、1.280（1.120～ 1.800）、1.570（1.090～ 2.180）LU。隨著ART時(shí)間的增加p24抗體水平呈逐漸降低的趨勢(shì)，且在ART 1、3、5年時(shí)與基線進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）（圖1 A）?？侶IV-1特異性抗體水平分別為3.378（3.157～3.710）、3.489（3.237～3.622）、3.446（2.742～ 3.573）、3.336（2.860～ 3.566）， 在ART期間沒(méi)有發(fā)生顯著變化（P 均＞ 0.05）（圖1 B）?？侶IV-1 DNA和CA-RNA水平在ART 0年時(shí)分別為3.580（3.200～3.750）和3.540（3.352～4.020）log10拷貝/106PBMC，ART 1年后水平均顯著下降，分別為3.060（2.790～3.280）和2.790（2.510～3.310）log10拷貝/106PBMC，隨后水平保持相對(duì)穩(wěn)定，且在ART 1、3、5年時(shí)的總HIV-1 DNA和CA-RNA水平與基線分別進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.05）（圖 1 C～D）。

圖1 長(zhǎng)期ART過(guò)程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體、總HIV-1 DNA和CA-RNA水平的變化Figure 1 Changes in p24 antibodies, total HIV-1 specific antibodies, total HIV-1 DNA and CA-RNA levels during long-term ART

2.3 長(zhǎng)期ART過(guò)程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體水平和總HIV-1 DNA、CA-RNA水平相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，p24抗體水平與總HIV-1 DNA和CARNA水平均呈正相關(guān)（P 均＜ 0.05）（圖2 A～B）。而總HIV-1特異性抗體水平與總HIV-1 DNA和CARNA水平均沒(méi)有相關(guān)性（P 均＞ 0.05）（圖2 C～D）。

圖2 ART過(guò)程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體水平和總HIV-1 DNA、CA-RNA水平的相關(guān)性Figure 2 Correlations between p24 antibodies and total HIV-1 specific antibodies levels and total HIV-1 DNA and CA-RNA levels during ART

3 討 論

近年來(lái)，AIDS功能性治愈是全球研究的熱點(diǎn)話(huà)題。所謂功能性治愈，是指中斷ART后，AIDS患者血漿中的HIV-1 RNA持續(xù)低于檢測(cè)下限，CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和機(jī)體的免疫功能保持正常[16]。HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)是目前AIDS功能性治愈的最大障礙，要想實(shí)現(xiàn)徹底清除HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)這一目標(biāo)，測(cè)量其大小顯得尤為重要。目前有關(guān)HIV-1特異性抗體水平與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小關(guān)系的研究結(jié)果存在爭(zhēng)議，限制了對(duì)AIDS功能性治愈的評(píng)估。本研究擬對(duì)不同HIV-1特異性抗體與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)之間的關(guān)系進(jìn)行探討，為AIDS功能性治愈的評(píng)估提供借鑒。

本研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期ART過(guò)程中，總HIV-1特異性抗體水平?jīng)]有發(fā)生明顯的變化，而p24抗體水平隨著ART時(shí)間的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)。p24是HIV-1的衣殼蛋白，在HIV-1的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此p24抗體是HIV-1診斷以及檢測(cè)疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)。關(guān)于ART導(dǎo)致p24抗體水平的降低，目前普遍觀點(diǎn)認(rèn)為是由于ART抑制了HIV-1的復(fù)制從而使抗原刺激缺乏導(dǎo)致的體液免疫缺陷[17-18]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)建立的早晚也會(huì)影響ART期間HIV-1抗體的水平[19]。在急性HIV-1感染期間接受ART可能會(huì)限制HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)的形成，并阻止HIV-1抗體反應(yīng)。然而，在慢性HIV-1感染期間，HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)已經(jīng)建立起來(lái)，ART無(wú)法將其徹底清除，將會(huì)產(chǎn)生持續(xù)不斷的抗原刺激。本研究中的HIV-1感染者在確診感染至少1個(gè)月以上才開(kāi)始接受ART，此時(shí)感染者體內(nèi)有持續(xù)不斷的抗原刺激機(jī)體維持一定的HIV-1抗體水平。這可能是本研究中總HIV-1特異性抗體水平在ART期間沒(méi)有發(fā)生明顯變化的原因。

本研究對(duì)長(zhǎng)期ART過(guò)程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體水平與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小之間的關(guān)系進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總HIV-1 DNA和CA-RNA水平在ART 1年后都顯著下降，隨后水平保持相對(duì)穩(wěn)定，與p24抗體水平的變化趨勢(shì)一致。經(jīng)過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期ART過(guò)程中總HIV-1 DNA和CA-RNA水平與p24抗體水平均呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，p24抗體水平與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小有關(guān)，p24抗體的水平可以區(qū)分儲(chǔ)存庫(kù)大小，與Burbelo等[11]研究結(jié)果一致。而夏陽(yáng)等[20]的研究對(duì)52例HIV-1感染者的總HIV-1 DNA水平以及p24抗體水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總HIV-1 DNA水平與p24抗體水平之間沒(méi)有相關(guān)性。以上結(jié)果不一致可能是患者差異所導(dǎo)致，包括治療方案的差異、病毒亞群差異及隨訪時(shí)間點(diǎn)差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)總HIV-1特異性抗體水平與總HIV-1 DNA 和CA-RNA沒(méi)有相關(guān)性，不能評(píng)估HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小。而有研究對(duì)柏林病人干細(xì)胞移植前后的抗體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析，結(jié)果顯示移植后柏林病人中仍可檢測(cè)到針對(duì)包膜蛋白的抗體，但針對(duì)核衣殼蛋白和聚合酶的抗體含量明顯下降[21]。以上研究表明不同HIV-1特異性抗體與HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小的關(guān)系不一致，為HIV-1特異性抗體水平和HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小關(guān)系的研究提供了指導(dǎo)。

綜上所述，總HIV-1特異性抗體水平隨著ART時(shí)間的增加沒(méi)有明顯變化，且與總HIV-1 DNA和CA-RNA水平?jīng)]有相關(guān)性；p24抗體水平隨著ART 時(shí)間的增加呈逐漸下降趨勢(shì)，且與總HIV-1 DNA以及CA-RNA水平均呈正相關(guān)關(guān)系。由此可見(jiàn)，患者體內(nèi)p24抗體水平具有評(píng)估其HIV-1儲(chǔ)存庫(kù)大小的臨床價(jià)值，值得進(jìn)一步推廣。但本研究存在一定的局限性，研究樣本量較少，縱向觀察時(shí)間較短（5年），該結(jié)論還須擴(kuò)大樣本量并延長(zhǎng)隨訪年限加以進(jìn)一步驗(yàn)證。