紅托竹蓀菌托多糖提取工藝優(yōu)化及其泡騰片的制備

李瑩，周克春，石芳，林棟

（貴陽學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005）

紅托竹蓀（Dictyophorarubrovalvata）主產(chǎn)地為云貴川地區(qū)，是珍貴的食用菌品種，也是貴州具有代表性的珍稀特色食用菌資源，尤以貴州織金產(chǎn)的紅托竹蓀脆嫩鮮甜、肉厚多汁為佳品，所以織金素有“竹蓀之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[1-2]。研究表明，紅托竹蓀含有多糖、氨基酸、類黃酮和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗癌、抗炎、抗氧化和提高免疫力等功效[3-6]，屬藥食兩用真菌，具有很好的開發(fā)前景。

竹蓀子實(shí)體主要由菌柄和菌裙（子實(shí)體）、菌帽、菌托三部分組成，其中竹蓀菌托的質(zhì)量約占子實(shí)體鮮重的40%[7]。菌托由外膜和膜間膠質(zhì)構(gòu)成，是撒裙和子實(shí)體抽柄在菌蕾時(shí)期的營養(yǎng)供給體，含有多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素等，其中菌托多糖含量高于其他部分[8]。食用菌多糖是一種能夠增強(qiáng)人體免疫功能的生物活性物質(zhì)，具有降血脂、降血糖、抗衰老、抗炎和抗腫瘤等功效，國際學(xué)術(shù)界稱之為生物應(yīng)答效應(yīng)物，受到藥學(xué)、功能食品等領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[9-12]。目前，在竹蓀的加工過程中，菌托部分常被當(dāng)作廢棄物處理，不僅污染環(huán)境，更是造成了資源的浪費(fèi)[13]。因此，竹蓀菌托的開發(fā)利用不僅有良好的商業(yè)價(jià)值，而且符合低碳環(huán)保的發(fā)展觀念[14]。

多糖的提取方法較多，有水提醇沉法、酸堿法、酶解提取法、微波輔助提取法、超高壓輔助提取法和超聲輔助提取法等[15]。趙凱等[12]研究發(fā)現(xiàn)，料液比和浸提時(shí)間對多糖得率的影響較大，通過正交試驗(yàn)獲得最佳條件為料液比1∶15（g/mL）、浸提時(shí)間4 h、提取2 次后的多糖得率為12.03%。吳雪艷等[16]利用響應(yīng)面法優(yōu)化竹蓀菌托多糖提取條件，發(fā)現(xiàn)液料比為62∶1（mL/g）、提取溫度為82 ℃、提取時(shí)間為3.1 h 時(shí)，竹蓀菌托多糖的提取率為13.02%。本研究采用超聲輔助提取法對紅托竹蓀菌托中的多糖進(jìn)行提取，以響應(yīng)面法優(yōu)化確定竹蓀菌托多糖提取工藝的最佳條件，并制備竹蓀菌托多糖泡騰片，以期為推進(jìn)紅托竹蓀功能食品的開發(fā)提供參考，為拓寬竹蓀多糖的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用范圍提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅托竹蓀菌托：貴州美味鮮竹蓀產(chǎn)業(yè)有限公司。4 倍體積無水乙醇浸泡48 h，抽濾，55 ℃烘干至恒重，粉碎過40 目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

無水乙醇、95%乙醇、苯酚、硫酸（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；正丁醇、丙酮、三氯甲烷、葡萄糖（均為分析純）：安徽酷爾生物工程有限公司；檸檬酸、碳酸氫鈉、阿斯巴甜、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）K30（均為食品級）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000（食品級）：曲阜市天利藥用輔料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204 分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；YF-150 研磨粉碎機(jī)：瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TD4 臺式低速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；UV755B 紫外分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；TDP-0 手搖單沖壓片機(jī)：邢臺榮武機(jī)械制造廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲輔助提取紅托竹蓀菌托多糖

稱量3.0 g 紅托竹蓀菌托干粉，超聲輔助提取2 次，4 000 r/min 離心15 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮（溫度75 ℃、轉(zhuǎn)速40 r/min、真空度0.06～0.07 MPa）至50 mL，冷卻至室溫（25 ℃）加入95%乙醇（多糖溶液∶95%乙醇=1∶3，體積比）醇沉，-4 ℃冰箱冷藏靜置24 h，4 000 r/min 離心15 min，抽濾，濾餅用無水乙醇和丙酮各洗滌1 遍，55 ℃烘箱干燥至恒重，即得粗多糖，稱質(zhì)量，多糖提取率（Y，%）的公式如下。

Y=（m1/m2）×100

式中：m1為提取液中粗多糖質(zhì)量，g；m2為紅托竹蓀干粉質(zhì)量，g。

1.3.2 多糖含量的測定

紅托竹蓀菌托多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[17]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液，稀釋至質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL 的溶液，取1 mL 樣品加入1 mL 6%苯酚，再緩慢加入5 mL 濃硫酸，搖勻冷卻后在490 nm 下測定吸光度（A），以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程為y=11.051x+0.002 4，R2=0.999。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

考察超聲功率（280、320、360、400、440 W）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]和超聲溫度（35、45、55、65、75 ℃）對紅托竹蓀菌托多糖提取率的影響。標(biāo)準(zhǔn)提取工藝條件為超聲功率400 W、超聲時(shí)間40 min、料液比1∶30（g/mL）、超聲溫度45 ℃。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲功率、超聲時(shí)間、料液比和超聲溫度4 個(gè)因素為自變量，以竹蓀菌托多糖提取率為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化竹蓀菌托多糖提取工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 粗多糖去蛋白、脫色及透析

菌托粗多糖研磨過80 目篩，按多糖∶水=1∶50（g/mL）加入蒸餾水，50 ℃超聲至完全溶解。根據(jù)多糖溶液與Sevage 試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1）體積比為3∶1，加入后充分振搖10 min，然后靜置20 min。重復(fù)操作3 次，充分去除蛋白質(zhì)。去蛋白后用1.5%活性炭脫色30 min，重復(fù)3 次。脫色后的多糖溶液先用棉花過濾掉活性炭，再用離心機(jī)4 000 r/min 離心15 min。上清液裝入透析袋透析48 h，溶液醇沉、干燥后即得脫色去蛋白多糖。

1.3.6 竹蓀菌托多糖泡騰片的制備

以紅托竹蓀菌托中提取的多糖為原料，采用酸堿分開制?；旌蠅浩ㄖ苽渑蒡v片。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以崩解效果、色澤、口感等綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，以酸堿比（2∶1、1.5∶1、1∶1）、黏合劑添加量（1%、2%、3%）、潤滑劑添加量（1.5%、2.0%、2.5%）、竹蓀菌托多糖添加量（1%、2%、3%）為影響因素，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)得出最佳原輔料比例。

1.3.7 竹蓀菌托多糖泡騰片的質(zhì)量評價(jià)

通過感官評價(jià)、發(fā)泡量、發(fā)泡時(shí)間、片重差異和崩解后溶液pH 值的測定，對制備的竹蓀菌托多糖泡騰片進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用SigmaPlot 12.5 作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Design Expert 11.0 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對多糖提取率的影響

超聲功率對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

由圖1 可知，超聲功率為280～400 W 時(shí)，多糖提取率隨超聲功率的增加而增加。超聲功率達(dá)到400 W時(shí)，多糖提取率最高，為10.28%。超聲功率超過400 W后，提取率降低。推測可能是由于超聲功率過高，破壞了多糖的分子結(jié)構(gòu)。因此，選擇超聲功率360、400、440 W 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 超聲時(shí)間對多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對紅托竹蓀多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

由圖2 可知，隨著超聲時(shí)間的延長，多糖的提取率先升高后降低。超聲時(shí)間為50 min 時(shí)，多糖提取率最高，為10.96%。繼續(xù)延長超聲時(shí)間，提取率呈降低趨勢。超聲時(shí)間較短時(shí)，產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)無法使多糖充分溶出，因此在一定時(shí)間內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長，多糖提取率呈上升趨勢。但過長的超聲時(shí)間會破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，大分子多糖可發(fā)生降解。因此提取多糖時(shí)要合理控制超聲時(shí)間，既要避免短時(shí)間提取不充分，又要防止長時(shí)間破壞多糖結(jié)構(gòu)。超聲40 min 和50 min 提取率差值較小，因此，選擇超聲時(shí)間30、45、60 min 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對紅托竹蓀多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖3 可知，隨著提取溶液體積的增加，多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，提取率為最大值13.31%。多糖的溶出主要依賴于細(xì)胞膜內(nèi)外濃度差，合適的濃度差有利于多糖的擴(kuò)散。料液比較小時(shí)，溶液黏度大、擴(kuò)散系數(shù)小，不利于提取；料液比過大，濃度差變小，但過多的提取液會造成試劑的浪費(fèi)和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮難度的增大。因此，選擇料液比1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 超聲溫度對多糖提取率的影響

超聲溫度對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對紅托竹蓀多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polysaccharides

由圖4 可知，隨著超聲溫度的升高，多糖提取率先上升后下降。當(dāng)超聲溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，多糖提取率最高，為9.72%；超聲溫度超過55 ℃后，多糖的提取率下降；當(dāng)超聲溫度達(dá)到75 ℃時(shí)，多糖提取率降至8.32%?？赡茉?yàn)檫^高的溫度破壞了多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使多糖發(fā)生降解。相比于熱水浸提法，超聲輔助提取法能將提取溫度降低20 ℃左右，節(jié)約能耗。由于55 ℃和65 ℃提取率差距較小，因此，選擇超聲溫度45、60、75 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸方程及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。采用響應(yīng)面軟件Design Expert 11.0 對表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 Analysis of variance table of the regression model

多元二次擬合方程為Y=13.81+0.29A+0.58B+0.16C+1.69D+0.37AB-0.02AC+0.13AD-0.11BC+0.71BD-0.12CD-0.73A2-1.45B2-0.24C2-1.90D2。回歸模型P＜0.001，該模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.182 3＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，由此可判斷該模型方程能夠?qū)Τ曒o助提取紅托竹蓀菌托多糖的提取率進(jìn)行可靠預(yù)測。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ痛_定系數(shù)R2=0.987 4，表明98.74%總變異可由模型解釋，模型擬合度高，試驗(yàn)誤差小。模型校正系數(shù)R2Adj=0.974 7，表示97.47%的響應(yīng)值變化可由模型進(jìn)行解釋。模型預(yù)測系數(shù)R2pre=0.934 2，表明該響應(yīng)面模型可預(yù)測93.42%的響應(yīng)值。一次項(xiàng)超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）與超聲溫度（D）影響極顯著（P＜0.01），料液比（C）影響顯著（P＜0.05），BD、A2、B2、D2極顯著（P＜0.01），AB、C2顯著（P＜0.05），其余項(xiàng)均不顯著。由顯著性及F值可知，對響應(yīng)值多糖提取率（Y）影響程度的大小依次為超聲溫度（D）＞超聲時(shí)間（B）＞超聲功率（A）＞料液比（C）。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面和等高線都可顯示試驗(yàn)因素之間相互作用，響應(yīng)面最高點(diǎn)即最佳提取工藝參數(shù)。響應(yīng)面傾斜度越高，即坡度越陡峭，表明因素間兩兩交互作用越顯著[18-19]。響應(yīng)面交互作用分析見圖5。

由圖5 可知，AC、BC、CD、AD間交互作用微小（P>0.05）；AB的響應(yīng)曲面傾斜度較高，二者的交互作用對響應(yīng)值（多糖提取率）的影響顯著（P＜0.05），BD響應(yīng)曲面坡度陡峭，說明二者的交互作用明顯強(qiáng)于其它交互項(xiàng)（P＜0.01）。

2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

依據(jù)模型預(yù)測，竹蓀菌托多糖的最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率419.312 W、超聲時(shí)間50.978 min、料液比1∶48.284（g/mL）、超聲溫度60.117 ℃。此時(shí)回歸模型的預(yù)測提取率達(dá)到14.18%。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作，將上述工藝參數(shù)值修改為超聲功率400 W、超聲時(shí)間51 min、料液比1∶48（g/mL）、超聲溫度60 ℃。平行試驗(yàn)3 次，多糖提取率為13.86%，與預(yù)測值接近。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化紅托竹蓀菌托多糖提取工藝參數(shù)，經(jīng)過平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，證明該試驗(yàn)得出最優(yōu)提取工藝具有可靠性，具備一定參考價(jià)值。

2.3 竹蓀菌托多糖泡騰片的最佳制備工藝

紅托竹蓀菌托中的多糖經(jīng)過去蛋白、脫色、透析后作為原料，利用酸堿分開制?；旌蠅浩ㄖ苽渑蒡v片。得出最佳配比組成為酸堿比（檸檬酸∶碳酸氫鈉）1.5∶1、泡騰崩解劑總量45%、黏合劑（3% PVP 水溶液）添加量2%、潤滑劑（PEG 6000）添加量2%、竹蓀菌托多糖添加量2%、甜味劑（阿斯巴甜）添加量1%。

2.4 竹蓀菌托多糖泡騰片的質(zhì)量評價(jià)結(jié)果

以最優(yōu)原輔料配比工藝制備的竹蓀菌托多糖泡騰片表面光滑、色澤均勻、無松片裂片現(xiàn)象，帶有竹蓀的特殊香氣，泡騰片的平均質(zhì)量為（2.96±0.04）g，質(zhì)量差異小于1%。各片均可在3 min 內(nèi)崩解完畢，且發(fā)泡體積大于6 mL，各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中國藥典》（2020 版）的規(guī)定[20]。竹蓀菌托多糖泡騰片溶于100 mL 水后溶液的pH 值在4.58～4.76，能適應(yīng)人們的口味需求[21]。

3 討論與結(jié)論

目前，關(guān)于竹蓀菌托多糖的提取工藝的研究較多，但主要是圍繞傳統(tǒng)的水提醇沉法展開，通常進(jìn)行料液比、提取時(shí)間和提取溫度等因素的優(yōu)化。對采用超聲波輔助提取紅托竹蓀菌托多糖的相關(guān)研究較少。本研究確定超聲波輔助提取紅托竹蓀菌托多糖工藝參數(shù)為超聲功率400 W、超聲時(shí)間51 min、料液比1∶48（g/mL）、超聲溫度60 ℃，此條件下的多糖提取率為13.86%。與傳統(tǒng)提取方法相比，本試驗(yàn)在縮短提取時(shí)間的同時(shí)提高了提取率。菌托作為紅托竹蓀加工過程中的廢棄物，多糖成分含量較高。泡騰片使用方便，生物利用度高，是功能食品劑型的優(yōu)良選擇，竹蓀菌托多糖具有降血脂、降血糖和抗衰老等功效。將多糖提取后制成泡騰片可以更好地發(fā)揮其藥理作用。試驗(yàn)通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)確定了竹蓀菌托多糖泡騰片的最佳配比組成：酸堿比（檸檬酸∶碳酸氫鈉）1.5∶1、泡騰崩解劑總量45%、黏合劑（3%PVP 水溶液）添加量2%、潤滑劑（PEG 6000）添加量2%、竹蓀菌托多糖添加量2%、甜味劑（阿斯巴甜）1%。其外觀、片重差異、pH 值、發(fā)泡量等均符合《中國藥典》（2020版）的質(zhì)量要求。本研究制備了竹蓀菌托多糖泡騰片，資源再利用的同時(shí)豐富了竹蓀產(chǎn)品的多樣性，具有廣闊的市場前景。