中南魚藤枝葉提取物對植物病原真菌的抑菌活性

劉啟鳳，張北京，尹豐滿，張 羲，胡 展，謝 佳，孫然鋒

（海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點實驗室/植物保護學(xué)院，海口 570228）

中南魚藤（Derris fordiiOliv.），又名毒魚藤、白藥根、雷公藤蹄，是豆科魚藤屬中的一種攀援灌木[1]，廣泛分布于我國長江以南地區(qū)，通常生長于浙江、湖北、湖南、海南、貴州、云南等省市的灌木林或疏林中[2]。中南魚藤在醫(yī)學(xué)方面常用于治療游走性關(guān)節(jié)炎、濕癩、老年陰道炎等。農(nóng)業(yè)方面，中南魚藤大多應(yīng)用于3個方面：（1）控釋肥料。多用于水稻[3]、辣椒、馬鈴薯[4]、南瓜、番茄、白蘿卜[5]、天冬、火龍果[6]、荔枝、香蕉、百香果[7?9]、山楂[10]、茶樹[11]等植物。（2）抗菌殺蟲處理劑。中南魚藤與其他材料制成的處理劑有較好的殺蟲效果，用于防治根結(jié)線蟲、蠐螬、蚜蟲等病蟲害[12]，多在水稻、瓜果類蔬菜[13]、果樹（貢柑）、板藍(lán)根等上使用，能提高產(chǎn)品的產(chǎn)量及品質(zhì)。此外，這些處理劑針對園林植物種子進(jìn)行防霉變處理，能顯著提高園林植物成活率[14]。（3）菇類培養(yǎng)基。中南魚藤被制成香菇[15]、杏鮑菇[16]等菇類的培養(yǎng)基，能促進(jìn)菇類的生長，提高產(chǎn)量且品質(zhì)更優(yōu)。此外，中南魚藤還可作為一種天然成分的甲醛去除劑[17]以及其與根瘤菌共生體可能在生態(tài)修復(fù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有應(yīng)用潛力。在海南，中南魚藤有著悠久的使用歷史，其為三大傳統(tǒng)殺蟲植物之一[18]，從中南魚藤根皮甲醇提取物中分離出了魚藤酮、12ɑ-羥基魚藤酮、6-甲氧基黃酮3種化合物，其中魚藤酮、12ɑ-羥基魚藤酮表現(xiàn)出良好的殺蟲活性[19]。魚藤酮是從魚藤屬植物中分離出來的一種化合物，具有較好的殺蟲活性，用于蚜蟲、菜粉蝶幼蟲、小菜蛾、孑孓等害蟲的防治[20?21]。目前，對中南魚藤的研究多在殺蟲活性方面，在抑菌方面還沒有系統(tǒng)的研究。本研究利用中南魚藤枝葉提取物，以9種植物病原真菌為靶標(biāo)進(jìn)行抑菌活性研究，以期發(fā)現(xiàn)中南魚藤新用途，為中南魚藤資源的充分利用及植物病原真菌的防治提供理論依據(jù)，為中南魚藤在殺菌活性方面的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料中南魚藤采自海南省昌江黎族自治縣霸王嶺，并經(jīng)海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院王華鋒教授鑒定；實驗所用有機溶劑（甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、DMF（N,N-二甲基甲酰胺）、吐溫?80）均為分析純，購于海南海道森科技有限公司；嘧菌酯（濃度為98%,上海源葉生物）和丙環(huán)唑（濃度為97%，Aladdin）原藥均購自北京伊諾凱科技有限公司；豇豆種子（Vigna unguiculata(Linn.) Walp.，摘不敗（廣東省興寧市慶豐盈科種子有限公司）。

1.2 供試菌種實驗供試菌種見表1。

表1 供試菌種

1.3 中南魚藤甲醇提取物及其各相萃取物的制備將中南魚藤枝葉剪成 10 cm 左右的小段，于50 ℃ 下烘干并粉碎。稱取 500.00 g粉末，用 6.00 L甲醇浸泡3 d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，重復(fù)3次，得到中南魚藤甲醇提取物浸膏54.05 g，于4 ℃件下保存?zhèn)溆?。將一定量的中南魚藤甲醇提取物用水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將各相萃取液濃縮后分別得到石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。將各相萃取物置于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 植物病原真菌離體抑菌活性測定利用菌絲生長速率法測定中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物對供試真菌的抑制活性。稱取一定量的中南魚藤甲醇提取物浸膏及各相萃取物，用DMF（N,N-二甲基甲酰胺）充分溶解后，配制成供試藥液，將藥液與馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）混勻，制成提取物濃度為 2.00 g·L?1、各相萃取物濃度為 1.00 g·L?1的帶藥培養(yǎng)基，以相同含量 DMF的PDA培養(yǎng)基為對照。病原真菌用直徑為0.5 cm的打孔器制成菌餅，接入帶藥培養(yǎng)基中間，設(shè)置3個重復(fù)。轉(zhuǎn)接好的病原菌置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組菌落直徑達(dá)到5.0 cm以上時，采用十字交叉法測量菌落的直徑。菌絲生長抑制率按下式計算：

式中：I表示抑制率，C表示對照組病原菌在培養(yǎng)上的直徑，T表示處理組病原菌在培養(yǎng)基上的直徑。

1.5 中南魚藤甲醇提取物對植物病原真菌菌絲EC50 值的測定稱取定量提取物浸膏，用 DMF 充分溶解配置成供試藥液，加入PDA培養(yǎng)基中，配置成一定濃度梯度的帶藥培養(yǎng)基，其他操作同1.3.2一樣。計算中南魚藤甲醇提取物對病原真菌的EC50值。

1.6 中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物對香蕉炭疽病分生孢子萌發(fā)抑制活性測定稱取定量的中南魚藤甲醇提取物浸膏及各相萃取物，溶于DMF中，配置成供試藥液，加入PDA培養(yǎng)基中充分混勻，制成一定濃度的帶藥培養(yǎng)基。吸取0.50 mL帶毒培養(yǎng)基置于載玻片上，待凝固后，在培養(yǎng)基表面均勻涂抹香蕉炭疽病菌孢子懸浮液（1×107CFU· mL?1），以含同等比例 DMF 的無菌水作為對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。處理后的載玻片置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照組孢子萌發(fā)率超95.00%后于顯微鏡下觀察各處理組孢子萌發(fā)情況，每個重復(fù)觀察3個視野，且記錄不少于300個分生孢子的萌發(fā)情況，并計算萌發(fā)率與相對抑制率。公式如下：

1.7 中南魚藤甲醇提取物對香蕉果實炭疽病的防治效果將稱取的中南魚藤甲醇提取物溶于DMF中，用0.1%吐溫-80水溶液稀釋成3.20、1.60 、1.00 、0.50 、0.10 g·L?1溶液。選取成熟度、大小一致、完好無損的香蕉，清洗香蕉自然晾干。將香蕉置于配置好的藥液中浸泡10 min，以嘧菌酯為陽性對照，含有同等比例DMF的0.5%吐溫-80水溶液為空白對照，自然晾干，24 h后，噴灑濃度為 1×107CFU·mL?1香蕉炭疽病菌分生孢子懸浮液，將處理過的香蕉置于28 ℃條件下培養(yǎng)，對照發(fā)病后，觀察各處理發(fā)病情況并分級，試驗進(jìn)行3次，每次試驗設(shè)置7個重復(fù)。其分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

1.8 中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物防治豇豆白粉病播種豇豆種子，待豇豆發(fā)芽后于溫室下正常培養(yǎng)15 d，選取二葉期長勢一致的豇豆苗作為供試植株。稱取中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物，用少量DMF溶解后，加入0.1%吐溫-80水溶液配置成一定濃度的供試藥液備用。用毛筆收集植株上的白粉孢子，配成濃度為1×107CFU· mL?1孢子懸浮液備用。將 12 mL 供試藥液用噴霧機均勻噴灑于5株豇豆葉片上，噴藥后等藥液自然晾干后，將豇豆置于溫室下正常培養(yǎng)，24 h后噴灑豇豆白粉病孢子懸浮液；噴灑藥液及豇豆白粉病孢子懸浮液時噴霧壓力均為 1.5 kg·cm?2。處理后的植株置于溫室（25 ℃，相對濕度80%）培養(yǎng)。每個處理設(shè)置5個重復(fù)。以丙環(huán)唑為陽性對照，設(shè)置等量DMF的吐溫-80水溶液作為空白對照。培養(yǎng)14 d后調(diào)查發(fā)病情況以及防治效果。實驗重復(fù)3次。豇豆白粉病分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

1.9 數(shù)據(jù)處理所有相關(guān)數(shù)據(jù)采用 Excel 2019和 SPSS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計和計算,利用 Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物對真菌離體抑菌活性的測定中南魚藤甲醇提取物對8種植物真菌離體抑菌活性測定結(jié)果（表2）表明，在濃度為 2.00 g·L?1時，中南魚藤甲醇提取物對其中7種植物病原菌抑制效果均大于60.00%，其中對香蕉炭疽病菌效果最為突出，其抑制率可達(dá)到82.15%。中南魚藤各相萃取物對8種植物病原真菌離體抑菌活性測定結(jié)果（表3）表明，各相萃取物濃度為 1.00 g·L?1時，乙酸乙酯相萃取物表現(xiàn)出較好的抑制活性，其對8種真菌的抑制率為53.09%～80.50%。此外，石油醚相萃取物對8種真菌的抑制率在44.44%～64.95%；正丁醇相萃取物對火龍果潰瘍病菌抑制效果最好（抑制率：54.55%），其對其余真菌抑制率均小于50%；水相萃取物對8種真菌抑制活性較差，抑制率均小于30%。

表2 中南魚藤甲醇提取物對 8 種植物病原真菌的抑菌活性

表3 中南魚藤各相萃取物對8種植物病原真菌的抑菌活性 /%

2.2 中南魚藤甲醇提取物對植物病原真菌菌絲EC50值的測定中南魚藤甲醇提取物對8種植物病原真菌EC50測定結(jié)果如表4所示，其對8種植物病原真菌的EC50為 0.24～1.33 g·L?1，其中中南魚藤甲醇提取物對香蕉炭疽病菌EC50最低(0.24 g·L?1)，說明中南魚藤甲醇提取物對香蕉炭疽病菌的生長抑制活性最好。

表4 中南魚藤甲醇提取物對8種植物真菌的EC50測定

2.3 中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)抑制活性的測定中南魚藤甲醇提取物對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對抑制率如圖1所示。結(jié)果表明，隨著中南魚藤甲醇提取物濃度的增加，其對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)抑制作用越來越明顯。當(dāng)中南魚藤甲醇提取物濃度為 0.50 g·L?1、0.80 g·L?1時，其相對抑制率均小于 50.00%；當(dāng)濃度大于 1.00 g·L?1時，其相對抑制率均高于 60.00%，其中當(dāng)濃度為 3.00 g·L?1時，抑制率可到93.76%。另外，當(dāng)甲醇提取物及各相萃取物濃度均為 1.00 g·L?1時（圖2），相較于甲醇提取物，石油醚相萃取物與乙酸乙酯相萃取物表現(xiàn)出較好活性（相對抑制率分別為84.56%、89.92%）。甲醇提取物與石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物相對抑制率分別為68.68%、37.32%、6.20%。

2.4 中南魚藤甲醇提取物對香蕉果實炭疽病的防治效果中南魚藤甲醇提取物對香蕉果實炭疽病防治效果（表5）表明，隨著提取物濃度的增加，其對香蕉果實炭疽病的防治效果越來越好。提取物濃度為 0.10 g·L?1、0.50 g·L?1、1.00 g·L?1時防治效果均小于 50.00%；當(dāng)提取物濃度大于 1.60 g·L?1時防效均大于 60.00%；當(dāng)濃度為 3.20 g·L?1時，防效為 71.11%，與 0.50 g·L?1嘧菌酯防效相當(dāng)。

表5 中南魚藤甲醇提取物對香蕉果實炭疽病的防治效果

2.5 中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物對豇豆白粉病病菌的防治效果中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物對豇豆白粉病的室內(nèi)盆栽防效實驗結(jié)果(圖3,表6)表明，中南魚藤甲醇提取物對豇豆白粉病有較好的防治效果，防治效果隨著中南魚藤濃度的增加越來越好，當(dāng)濃度為 0.50 g·L?1防治效果可超過 50.00%；當(dāng)濃度為 1.00 g·L?1時，防效可達(dá)91.67%。中南魚藤甲醇提取物分相后，濃度為1.00 g·L?1時，石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、水相萃取物防效均低于60.00%，正丁醇相萃取物防治效果最好，防效為94.07%，效果優(yōu)于濃度為 0.025 g·L?1的商品化農(nóng)藥丙環(huán)唑。

表6 中南魚藤甲醇提取物及各相萃取物對豇豆白粉病的室內(nèi)盆栽防效

3 討 論

在農(nóng)業(yè)方面，魚藤屬植物是很多殺蟲活性物質(zhì)的主要來源， LI[22]從中南魚藤根皮中成功分離出魚藤酮并測定了殺蟲活性。 HYMAVATHI A[23]從攀緣魚藤（Derris scandens）中分離出9種化合物，其對綠豆象（Callosobruchus chinensisL.）、米象 （Sitophilus oryzaeL.） 、 谷 蠹 （Rhyzopertha dominicaL.）、赤擬谷盜（Tribolium castaneumH.）四種倉貯害蟲表現(xiàn)出不同程度的殺蟲活性。WU X[24]等從毛魚藤（Derris elliptica）中分離出 5 個化合物對白紋伊蚊（Aedes albopictus）幼蟲表現(xiàn)出較好殺蟲活性。魚藤屬中多種植物提取物對細(xì)菌也表現(xiàn)出良好抑菌活性，其中，魚藤（Derris trifoliata）對黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermides）表現(xiàn)出高活性[25]；馬來魚藤（Derris malaccensis）對幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 具有較好抑菌活性[26]；攀緣魚藤對枯草芽孢桿菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性[27]。魚藤屬植物中關(guān)于防治植物病原真菌的相關(guān)報道較少，目前在對中南魚藤的研究中未見關(guān)于其對植物病原真菌抑菌活性的報道。本研究結(jié)果表明，中南魚藤枝葉提取物對8種植物病原真菌均有較好的抑制作用，中南魚藤甲醇提取物對8種真菌的EC50均在 1.35 g·L?1以下。香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)抑制活性測定結(jié)果表明，中南魚藤甲醇提取物和乙酸乙酯相萃取物都表現(xiàn)出較好抑制活性，孢子萌發(fā)實驗結(jié)果正好與香蕉炭疽病菌菌絲生長速率法測定結(jié)果相一致，均是乙酸乙酯相萃取物的活性較好。香蕉果實炭疽病的防治效果表明，中南魚藤甲醇提取物對香蕉果實炭疽病有較好的防治作用，其中中南魚藤甲醇提取物濃度為3.20 g·L?1時，防效可達(dá)71.11%。在豇豆白粉病病菌防治實驗中，中南魚藤提取物表現(xiàn)出較好的防治效果，其中，中南魚藤甲醇提取物與正丁醇相萃取物濃度為 1.00 g·L?1時，防效均超過 90.00%。張慧等[28]的研究結(jié)果表明，毛枝魚藤（Derris scabricanlis）葉片甲醇提取物濃度為 100 g·L?1時，對荔枝霜疫霉的抑制率為 88.89 %；ZAHARI R[29]測定了毛魚藤葉部提取物對3種根腐病病原菌（Ganoderma philippii、Phellinus noxius、Rigidoporus microporus）的抑菌活性，結(jié)果表明只有丙酮萃取物和二氯甲烷萃取物對Rigidoporus microporus表現(xiàn)出顯著抑菌活性。KHAN M R[30]測定了魚藤、毛魚藤和印度魚藤（現(xiàn)正名為水黃皮Pongamia pinnata(L.) Pierre）對Aspergillus niger,Aspergillus rubrum,Aspergillus versicolor等9種真菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)3種植物對9種真菌均無抑菌活性。綜上所述，筆者認(rèn)為中南魚藤在防治植物病害方面，特別是防治香蕉炭疽病和豇豆白粉病更具有潛在研究價值。

中南魚藤乙酸乙酯相萃取物對多種植物病原真菌具有較突出的抑制作用，正丁醇相萃取物在豇豆白粉病防治中有較突出的效果，因此可進(jìn)一步對中南魚藤乙酸乙酯相萃取物及正丁醇相進(jìn)行分離提純，以期分離出對香蕉炭疽病菌及豇豆白粉病菌有高活性的化合物。此外，由于中南魚藤提取物來源于植物，在使用其防治病害過程中具有對環(huán)境友好、不易讓病原菌產(chǎn)生抗藥等特點[31]。這些優(yōu)點從側(cè)面說明對中南魚藤進(jìn)行進(jìn)一步研究的意義所在。本研究只對中南魚藤抑菌活性進(jìn)行了初步探究，未來可在中南魚藤抑菌活性化合物分離鑒定、抑菌機制以及在田間試驗中對農(nóng)作物病害的防治效果等方面進(jìn)行更深入的探討。

4 結(jié) 論

中南魚藤枝葉提取物對多種植物病原真菌具有較好的抑菌活性，可以拓展其在農(nóng)作物病害防治上的新用途，特別是在助力鄉(xiāng)村振興和在發(fā)展有機果蔬生產(chǎn)上提供綠色、無公害農(nóng)藥的更多選擇。