靈芝孢子殼聚糖分離提取工藝優(yōu)化研究

叢文欽，陳 罡，祝儒剛，高英旭*，趙濟川，范俊崗

（1.遼寧大學 輕型產(chǎn)業(yè)學院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧省林業(yè)科學研究院，遼寧 沈陽 110032）

殼聚糖（Chitosan）是一種由2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖通過β-（1→4）糖苷鍵連接而成的線性多糖，也是唯一大量存在的陽性多糖，主要來源于幾丁質（Chitin，又名甲殼素）經(jīng)強烈堿水解或生物酶分解脫去N-乙酰基的過程[1]。相較于幾丁質，殼聚糖具有更高的溶解性和更完善的功能特性，如抗菌性、抗氧化性、生物相容性、組織相容性等性質[2]。正因如此，殼聚糖在食品、醫(yī)藥、化妝品等眾多領域有著廣泛的應用，是一種極具應用前景的天然多糖。傳統(tǒng)市售商品化殼聚糖來源于海洋副產(chǎn)品，制備過程需脫鹽、脫礦、脫蛋白等眾多化學反應步驟，既不能免除蝦蟹等海洋副產(chǎn)品帶來的致敏性問題[3]，又可能受到來自眾多反應過程中的污染。因此，探究更多天然殼聚糖來源的研究十分具有現(xiàn)實意義。

靈芝孢子是擔子菌門多孔菌科腐生真菌靈芝Ganodermalucidum的生殖細胞，具有靈芝全部遺傳生物活性物質，如多糖、三萜、甾醇等物質，有多種功效和醫(yī)學研究價值。其主要結構為雙層壁結構，以透明外孢壁和深褐色內(nèi)壁組成，主要成分為幾丁質[4]，這也導致靈芝孢子粉內(nèi)部生物活性物質難以被人體直接吸收。將其內(nèi)活性物質提取后再進行利用則可避免直接服用導致的消化不良、便秘等癥狀，但提取后的殘渣若棄之不用，便會造成靈芝資源的浪費。因此，本研究采用過程較為簡單的化學法將靈芝孢子粉破壁后殘渣中的殼聚糖進行分離純化，并對提取工藝進行優(yōu)化，以制備具有良好品質的靈芝孢子殼聚糖，為殼聚糖的分離純化提供新的方向和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

靈芝孢子粉殘渣為靈芝孢子粉（取自遼寧省林業(yè)科學院新賓縣靈芝栽培示范基地）用破壁機破壁后收集所得殘渣。實驗用試劑氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸、過氧化氫均為分析純。其中，氫氧化鈉購自天津市大茂化學試劑廠；鹽酸購自天津市永大化學試劑有限公司；冰乙酸購自天津博迪化工股份有限公司；過氧化氫購自沈陽市東興試劑廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 殼聚糖的提取

1.2.1.1 幾丁質的制備

將提取過生物活性物質后的靈芝孢子殘渣烘干后研細，按照Liao等[5]的方法，準確稱取一定質量的靈芝孢子粉殘渣與2%NaOH以1∶20（g：mL）的比例置于85℃水浴中4 h。結束后，待混合液冷卻，在7 000 r·min-1、室溫條件下離心15 min，收集沉淀物并用超純水清洗至中性，置于65℃烘箱中干燥過夜，保存待用。

1.2.1.2 脫 色

按照Chen等的方法[6]，將靈芝孢子幾丁質與30%H2O2以1∶10（g：L）的比例置于70℃水浴中進行漂白2 h。待混合物冷卻后，用NaOH溶液將混合物pH值調(diào)節(jié)至中性，在室溫條件下7 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀即為靈芝孢子幾丁質，干燥備用。

1.2.1.3 幾丁質脫乙酰基制備殼聚糖

根據(jù)朱禮芳[7]所述方法，取靈芝孢子幾丁質1 g，按照設定比例與一定質量分數(shù)的NaOH溶液充分混勻，然后置于熱水浴中保持預設時間。結束后冷卻，在室溫條件下7 000 r·min-1離心15 min，收集沉淀，用超純水洗滌至pH值7，靜置過夜，再次離心，將沉淀物烘干，即為粗靈芝孢子殼聚糖。

1.2.1.4 殼聚糖的純化

將粗靈芝孢子殼聚糖與質量分數(shù)10%的醋酸溶液混合，超聲輔助使其溶解，在7 000 r·min-1條件下離心10 min，棄去沉淀，取上清液再用質量分數(shù)為30%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值＞9，此時出現(xiàn)大量白色沉淀。將所得混合液再次離心，收集沉淀并洗滌至pH值呈中性，于65℃烘箱烘干即為靈芝孢子殼聚糖。

1.2.2 單因素試驗

分別以NaOH質量分數(shù)、反應溫度、反應時間3個因素作單因素試驗，考察各單因素對靈芝孢子殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響情況。

1.2.2.1 NaOH質量分數(shù)

固定料液比1∶30，NaOH質量分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%，于90℃水浴5 h，研究不同質量分數(shù)NaOH對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響。

1.2.2.2 溫度

固定料液比1∶30，NaOH質量分數(shù)為30%，分別于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴5 h，研究不同溫度對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響。

1.2.2.3 時間

固定料液比1:30，NaOH質量分數(shù)為30%，于90℃水浴2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，研究不同水洉時間對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響。

1.2.3 正交試驗

基于單因素試驗結果確定范圍，以靈芝孢子幾丁質為原料，以殼聚糖的脫乙酰度為因變量，以NaOH質量分數(shù)、反應溫度和反應時間為自變量，通過正交試驗（表1）進行工藝參數(shù)優(yōu)化，確定靈芝孢子殼聚糖的最佳提取工藝條件。

表1 正交試驗各因素及水平

1.2.4 殼聚糖質量指標分析

本試驗以水分、灰分、酸溶性、脫乙酰度、粘度等指標對殼聚糖質量進行分析，參照GB 29941-2013《食品安全國家標準食品添加劑脫乙酰甲殼素（殼聚糖）》。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗平行組均為3組，結果取平均值。采用SPSS軟件（SPSS Statistics v18，IBM，UK）統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響

2.1.1 NaOH質量分數(shù)

由圖1可知，靈芝孢子殼聚糖脫乙酰度總體趨勢隨著NaOH質量分數(shù)的增加而增加，在10%～30%范圍內(nèi)脫乙酰度增加較快，達到30%以后趨于平緩；殼聚糖產(chǎn)率在質量分數(shù)大于30%時下降較為明顯，可能是隨著NaOH質量分數(shù)的增加，殼聚糖分解加劇而導致的[8]。因此，選擇質量分數(shù)為30%的NaOH較為合適。

圖1 NaOH質量分數(shù)對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率影響

2.1.2 溫 度

由圖2可知，靈芝孢子殼聚糖脫乙酰度隨反應溫度逐漸增加，幾丁質乙?；趬A的作用下轉化為氨基的反應更加劇烈，90℃后變化趨緩；正因如此，高溫加劇了殼聚糖分子的降解反應[9]，導致殼聚糖產(chǎn)率大幅下降。溫度在80℃時基本可以保證殼聚糖的脫乙酰過程進行，同時對于產(chǎn)率影響較小，因此80℃為最適反應溫度。

圖2 溫度對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響

2.1.3 時間

由圖3可知，時間對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率影響與NaOH質量分數(shù)、反應溫度相似。脫乙酰度在反應進行4 h后趨于平穩(wěn)，但產(chǎn)率也開始快速下降，可能與殼聚糖分解反應逐漸加劇有關，因此反應時間控制在4 h能達到較好的提取效果。

圖3 時間對殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗得到的最適反應范圍，以殼聚糖脫乙酰度為單一變量進行正交試驗，結果如表2所示。其中，9號試驗組的脫乙酰度最高（91.27%），能得到質量相對較好的殼聚糖，可視作試驗中最佳反應條件。根據(jù)單因素分析法比較表3中F值可知[6]，各因素對殼聚糖脫乙酰度影響程度為NaOH質量分數(shù)＞溫度＞時間；由同一水平各因素極差K值大小關系可知最優(yōu)條件組合為40%NaOH、90℃、4 h，這與獲得最好效果的9號試驗組結果一致。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

2.3 靈芝殼聚糖質量指標

采用正交優(yōu)化后的工藝制備靈芝孢子殼聚糖，以殼聚糖產(chǎn)品國家GB29941-2013標準比較其產(chǎn)品指標情況，結果見表4。所得到的靈芝孢子殼聚糖具有良好外觀品質，易溶于酸，脫乙酰度較高，且可重復性好，因此具有較高利用價值。

表4 靈芝殼聚糖質量指標

3 結論

來源于真菌的殼聚糖產(chǎn)品不但具有殼聚糖良好的性能，同時也能避免海洋副產(chǎn)物帶來的不良問題，為殼聚糖的應用帶來新的方向，因此十分具有潛力。本試驗利用靈芝孢子粉破壁后收集的殘渣所制備的幾丁質來提取殼聚糖，既實現(xiàn)了靈芝孢子粉的高效利用，又為探索一種新來源的殼聚糖提供了堅實的理論基礎。

本實驗對化學法提取靈芝孢子殼聚糖工藝進行優(yōu)化，研究了NaOH質量分數(shù)、反應溫度、反應時間3個因素對于殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響，并對提取的靈芝孢子殼聚糖進行質量指標分析。結果發(fā)現(xiàn)NaOH質量分數(shù)對靈芝孢子殼聚糖的脫乙酰反應影響最為顯著，堿液含堿量越高幾丁質脫乙酰過程越劇烈，殼聚糖脫乙酰度越高。其他兩因素也存在相同的影響趨勢。但隨著反應條件的增強，殼聚糖的分解也越強烈，將導致產(chǎn)率大幅下降，因此選擇足夠且較為適度的脫乙酰條件至關重要。在此基礎上進行3因素3水平正交試驗，并得到了靈芝孢子殼聚糖提取的最佳工藝：NaOH質量分數(shù)為40%、溫度90℃、水浴時間4 h，得到的殼聚糖脫乙酰度為91.52%，水分、灰分、粘度等指標均符合相關標準中對于殼聚糖產(chǎn)品的質量要求，這說明經(jīng)本試驗優(yōu)化后的靈芝孢子殼聚糖提取工藝能達到較為理想的水平。在后續(xù)試驗中，還需對此殼聚糖理化性質、生物活性等進一步研究，以達到綜合分析的目的。