乳酸菌富硒及產胞外多糖條件的研究

白芳芳，張榮榮，原倩倩，于鈺杰，李坤學，馬玲

(山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801)

硒是一種人體必需的微量元素[1]，是谷胱甘肽過氧化物酶、硒磷酸酯合成酶等酶活性中心的組成成分[2-5]，可改善機體免疫功能，增強抵抗力，保護心血管和心肌的健康，防癌抗癌，是重金屬的天然解毒劑等，并且能促進身體生長，保護視覺器官[6-8]。2017年中國營養(yǎng)學會推薦14歲以上居民每日攝入膳食硒量為60 μg[9-10]，人體缺硒會引發(fā)克山病、癌癥、心腦血管疾病、甲狀腺功能障礙等[11]。

硒多糖是多糖與硒的復合物，是有機硒化合物的一種，同時具有硒和多糖的生物活性，但天然的硒多糖并不多，僅存在于某些動植物和微生物中。利用乳酸菌對亞硒酸鈉的轉化，產物穩(wěn)定，毒性減弱[12]，但需確定培養(yǎng)條件，乳酸菌硒多糖的產量與多種因素有關，例如碳源、氮源、培養(yǎng)時間、溫度、培養(yǎng)次數、亞硒酸鈉濃度等[13]。陳春[14]的研究表明桑葚多糖組分均具有較好的抗氧化活性，能夠抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，降低機體對糖分的吸收速度，并且經過與硒結合后，抗氧化活性顯著增強，增加了組織細胞對葡萄糖的吸收能力，提高了人體葡萄糖耐量，從而具有降血糖的功能。硒化乳酸菌胞外多糖的免疫激活作用優(yōu)于胞外多糖，硒多糖可激活淋巴細胞的鈣通道，有效促進免疫功效，同時富硒胞外多糖還具有抗腫瘤的功效[15-16]。

微生物可通過生物轉化將無機硒轉化為有利于人體吸收利用的有機硒及單質硒[17-19]，有機硒化合物的毒性低[20]，在激發(fā)免疫反應上比無機硒顯著[21]，且吸收率更高。大量研究表明大多乳酸菌(如植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌等)都具有富硒能力，Calomme等[22]研究發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌將硒非特異性地摻入細菌蛋白質中，將無機硒生物轉化為硒代半胱氨酸。此外，乳酸菌對硒具有一定的耐受能力，趙愛兵[23]通過復合誘變選育高富硒嗜熱鏈球菌種，將菌株ZZ-CW4的富硒率提升至83.43%。楊鶴[24]對5種乳酸菌的富硒能力進行了研究，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌08001的富硒能力較好，此外，還發(fā)現(xiàn)當不同乳酸菌進行復配時，富硒能力顯著高于單一菌株的富硒能力(P<0.05)。

本試驗選用6種乳酸菌為研究對象，通過測定生長曲線確定各個菌種生長的穩(wěn)定期，加入不同濃度的亞硒酸鈉，以確定菌種的耐硒濃度。在菌種的不同耐硒濃度條件下，以3,3′-二氨基聯(lián)苯胺法測定菌種的富硒率，苯酚-硫酸法測定其胞外多糖含量，篩選出同時具有較高富硒率和胞外多糖含量的菌種，通過正交試驗優(yōu)化菌種富硒及產胞外多糖條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)：由山西農業(yè)大學畜產實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[25](牛肉膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母膏5.0 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL, 磷酸氫二鉀2.0 g, 乙酸鈉5.0 g, 檸檬酸氫二銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，蒸餾水1000 mL)、M17培養(yǎng)基：均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 試驗試劑

鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、苯酚、無水乙醇：天津風船化學試劑有限公司；亞硒酸鈉：成都麥卡?；び邢薰?；3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB)：西格瑪奧德里奇有限公司；三氯乙酸：天津凱通化學試劑有限公司；試劑均為分析純。

1.3 主要設備

WFJT200型可見分光光度計 尤尼科儀器有限公司；HY-2調速多用振蕩器 常州國華電器有限公司；ST-2100 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；5801R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BenchTop Pro真空冷凍干燥機 德祥科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的活化[26]

將嗜熱鏈球菌選用M17培養(yǎng)基在42 ℃條件下活化3代，嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、動物雙歧桿菌、副干酪乳桿菌和植物乳桿菌則選用MRS培養(yǎng)基在37 ℃條件下活化3代。

1.4.2 菌種生長曲線的繪制[27]

已活化的嗜熱鏈球菌在M17培養(yǎng)基中以接菌量3%進行培養(yǎng)24 h，每間隔2 h測定其在600 nm處的吸光度值，并繪制菌種生長曲線。其余5種菌種則在MRS培養(yǎng)基中同條件下進行培養(yǎng)，并繪制OD600 nm生長曲線。

1.4.3 乳酸菌耐硒濃度的確定

根據各菌種的生長曲線，選擇在菌種對數期時加入1 mg/mL亞硒酸鈉溶液，使其在培養(yǎng)基中的濃度為0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg/mL，培養(yǎng)24 h后觀察試管底部顏色變化。

1.4.4 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺法測定乳酸菌富硒含量

1.4.4.1 標準曲線的繪制

參考楊靖鵬等[28]的方法，并稍加修改。稱取0.1000 g亞硒酸鈉，與鹽酸按1∶1混合，溶解后定容至100 mL容量瓶中。吸取1 mL定容后的液體稀釋50倍，再吸取稀釋液0，2，4，6，8，10 mL至燒杯中，加蒸餾水使溶液體積為35 mL，分別加入5% EDTA-2Na溶液1 mL，調節(jié)溶液pH值至2.5，分別加入0.5% DAB溶液4 mL，暗反應30 min，使用5%的NaOH將溶液pH值調節(jié)至7.0。將上述溶液加至分液漏斗中，與10 mL甲苯溶液混合，振搖，靜置使溶液分層，取甲苯層在420 nm處測量吸光度值。

1.4.4.2 樣品的測定

取40 mL樣品，以4000 r/min離心30 min，吸取20 mL離心后的液體，加蒸餾水使溶液體積為35 mL，加入5% EDTA-2Na溶液2 mL，下同標曲。

1.4.5 苯酚硫酸法測定乳酸菌產胞外多糖含量

1.4.5.1 標準曲線的繪制

參考李進等[29]的苯酚-硫酸法測胞外多糖含量，并繪制標準曲線。

1.4.5.2 胞外多糖的提取

將發(fā)酵液樣品沸水浴10 min，冷卻至室溫后加入濃度為80%的三氯乙酸使其終濃度為7%，4 ℃靜置過夜，10000 r/min離心15 min除去菌體和變性蛋白，抽濾除去雜質，旋蒸濃縮體積至原體積的1/3，再加入2～3倍體積的無水乙醇，靜置使多糖析出，將溶液以10000 r/min離心10 min，保留沉淀，加蒸餾水透析48 h收集多糖溶液進行胞外多糖含量的測定。

1.4.6 乳酸菌富硒單因素試驗

1.4.6.1 亞硒酸鈉濃度對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響

以接菌量為3%，培養(yǎng)時間為24 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃，添加亞硒酸鈉濃度為5，7.5，10，12.5，15 μg/mL，測定乳酸菌的胞外多糖產量及富硒率。

1.4.6.2 培養(yǎng)時間對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響

以接菌量為3%，添加亞硒酸鈉濃度為10%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時間為12，24，36，48，60 h，測定乳酸菌的胞外多糖產量及富硒率。

1.4.6.3 接菌量對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響

以培養(yǎng)時間為24 h，添加亞硒酸鈉濃度為10%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，接菌量為2%、3%、4%、5%、6%，測定乳酸菌的胞外多糖產量及富硒率。

1.4.6.4 培養(yǎng)溫度對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響

以接菌量為3%，添加亞硒酸鈉濃度為10%，培養(yǎng)時間為24 h，培養(yǎng)溫度為33，35，37，39，41 ℃，測定乳酸菌的胞外多糖產量及富硒率。

1.4.7 正交試驗優(yōu)化乳酸菌富硒條件

由單因素試驗結果得出各因素適宜條件，以乳酸菌胞外多糖含量和富硒率為測定指標進行三因素三水平的正交試驗，設計見表1。

表1 正交試驗的因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.5 數據統(tǒng)計分析

試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示，使用Statistix 8.1進行數據顯著性分析，使用IBM SPSS Statistics 25進行數據統(tǒng)計分析，使用Origin 9.0繪圖軟件繪制圖。

2 結果與分析

2.1 菌種生長曲線

6種乳酸菌的生長曲線見圖1。

圖1 6種乳酸菌生長曲線Fig.1 The growth curves of six strains of lactic acid bacteria

由圖1可知，鼠李糖乳桿菌、動物雙歧桿菌和植物乳桿菌在培養(yǎng)3 h后進入對數期，持續(xù)到10 h；嗜熱鏈球菌在培養(yǎng)4 h后進入對數期，持續(xù)到8 h；副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌在培養(yǎng)4 h后進入對數期，持續(xù)到12 h。因此鼠李糖乳桿菌、動物雙歧桿菌和植物乳桿菌選擇在培養(yǎng)5 h后添加亞硒酸鈉，副干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌在培養(yǎng)6 h后添加亞硒酸鈉，嗜酸乳桿菌則在培養(yǎng)8 h后添加亞硒酸鈉。選擇對數期作為加硒時間，有利于菌體轉化無機硒和單質硒。宋照軍等[30]研究表明在嗜熱鏈球菌生長代謝旺盛時加入亞硒酸鈉，對菌體代謝活動抑制較弱，此時有著較高的轉化率。

2.2 乳酸菌富硒顏色變化

在6種乳酸菌生長對數期添加不同質量濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)24 h后，各種菌株的顏色變化為：植物乳桿菌在亞硒酸鈉質量濃度為10 μg/mL，嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌在亞硒酸鈉質量濃度為15 μg/mL，鼠李糖乳桿菌、動物雙歧桿菌和副干酪乳桿菌在亞硒酸鈉質量濃度為20 μg/mL時，顏色均為微紅。Xia等[31]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在富硒過程中，將一部分無機硒合成硒代胱氨酸，而另一部分則可將無機硒還原成單質硒，試驗中菌體變紅，則是由于培養(yǎng)基中存在單質硒，說明菌體將部分亞硒酸鈉還原成單質硒。

隨著亞硒酸鈉濃度的不斷增大，部分菌體的顏色逐漸加深，最終呈現(xiàn)深紅色，而嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌耐硒濃度較低，在較高的亞硒酸鈉質量濃度下菌株已無法正常生長。黃秀錦[32]研究乳桿菌的富硒條件時，發(fā)現(xiàn)隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，生物量急劇下降，乳酸菌對硒的富集由生理性富集轉變?yōu)椴±硇愿患?。因此，選擇在0～20 μg/mL亞硒酸鈉質量濃度下培養(yǎng)的乳酸菌進行富硒率的測定。

2.3 乳酸菌富硒率及產胞外多糖含量測定

由3,3′-二氨基聯(lián)苯胺法測得的硒標準曲線為：y=0.0029x+0.093，R2=0.9919。由苯酚硫酸法測得的胞外多糖含量標準曲線為：y=0.0151x+0.0756，R2=0.9982。

測定6種乳酸菌富硒率的結果見圖2。

圖2 6種乳酸菌添加不同亞硒酸鈉質量濃度下的富硒率Fig.2 Se enrichment rates of six strains of lactic acid bacteria with different concentration of sodium selenite

由圖2可知，在亞硒酸鈉質量濃度為0～20 μg/mL時，6種乳酸菌均具有富硒能力，而亞硒酸鈉質量濃度影響乳酸菌對硒的富集作用。隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，各乳酸菌的富硒率呈先增加后下降的趨勢。在亞硒酸鈉質量濃度為15 μg/mL時，鼠李糖乳桿菌的富硒率最大，為81.48%；當濃度超過15 μg/mL時，富硒率呈現(xiàn)整體下降趨勢，菌株的生長受到了抑制。徐穎等[33]的研究表明在亞硒酸鈉質量濃度為8～12 μg/mL時，乳酸菌的富硒率趨于平穩(wěn)。鼠李糖乳桿菌在各亞硒酸鈉濃度下的生長情況較其他菌種良好，選定鼠李糖乳桿菌作為耐硒菌種。

測定6種乳酸菌添加不同亞硒酸鈉質量濃度下胞外多糖含量的結果見圖3。

圖3 6種乳酸菌添加不同亞硒酸鈉質量濃度下的胞外多糖含量Fig.3 Extracellular polysaccharide content of six strains of lactic acid bacteria with different concentration of sodium selenite

由圖3可知，亞硒酸鈉的添加對乳酸菌的胞外多糖含量有影響。當添加一定質量濃度的亞硒酸鈉時，各乳酸菌的胞外多糖含量均低于未硒化時；隨著亞硒酸鈉質量濃度的增大，嗜熱鏈球菌和鼠李糖乳桿菌的胞外多糖含量呈先上升后下降的趨勢，這可能是因為低濃度的亞硒酸鈉可促進這兩種乳酸菌的生長[34]，當添加大于10 μg/mL的亞硒酸鈉時，菌株的生長受到抑制，多糖的含量降低。植物乳桿菌、動物雙岐桿菌、副干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的生長受亞硒酸鈉的影響較大，胞外多糖含量隨著亞硒酸鈉質量濃度的增大不斷降低。當亞硒酸鈉質量濃度為10 μg/mL時，鼠李糖乳桿菌的胞外多糖產量為51.48 μg/mL，高于其余菌種。結合6種乳酸菌富硒率的結果，選擇鼠李糖乳桿菌作為產胞外多糖的耐硒菌種進行單因素試驗。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 亞硒酸鈉濃度對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響

由圖4可知，亞硒酸鈉質量濃度的變化影響鼠李糖乳桿菌的富硒率和胞外多糖含量。隨著亞硒酸鈉質量濃度的增大，菌種的富硒率和胞外多糖含量先增大后減小。當亞硒酸鈉濃度為12.5 μg/mL時，鼠李糖乳桿菌的富硒率達到最大值，為85.41%；當亞硒酸鈉為10 μg/mL時，鼠李糖乳桿菌的胞外多糖含量達到最大值，為52.21 μg/mL；隨著亞硒酸鈉濃度的增大，菌體的生長受到抑制，鼠李糖乳桿菌的富硒率和胞外多糖含量均顯著降低(P<0.05)。

圖4 亞硒酸鈉濃度對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響Fig.4 Effect of sodium selenite concentration on selenium enrichment rates and extracellular polysaccharide content of lactic acid bacteria

2.4.2 培養(yǎng)時間對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響

由圖5可知，在培養(yǎng)12～24 h時，鼠李糖乳桿菌的富硒率(80.05%)顯著增加(P<0.05)，而后隨著時間的增加，產量不斷下降。菌株胞外多糖的峰值(46.8 μg/mL)則在培養(yǎng)36 h時出現(xiàn)，此后顯著下降(P<0.05)。培養(yǎng)時間過長，菌體細胞不斷衰亡，葡萄糖激酶、轉葡萄糖苷酶以及烯醇丙酮酸磷酸-糖磷酸轉移酶等的活性下降，不再合成和分泌胞外多糖[35]，同時菌體長時間的培養(yǎng)會產生更多的單質硒，富硒率也出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)。

圖5 培養(yǎng)時間對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響Fig.5 Effect of culture time on selenium enrichment rates and extracellular polysaccharide content of lactic acid bacteria

2.4.3 接菌量對乳酸菌富硒及產胞外多糖的影響

由圖6可知，隨著接菌量的增大，鼠李糖乳桿菌的富硒率和胞外多糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當接菌量過低時，菌體量不足，菌體對硒的富集能力以及合成胞外多糖能力較低，而接菌量過大時，菌體消耗過多的碳源，培養(yǎng)液的低pH影響酶的活性，不利于胞外多糖的積累[36]。當接菌量為5%時，菌株的富硒率和胞外多糖含量均達到最大值，分別為83.18%和59.03 μg/mL。因此，選擇接菌量為5%時，能使菌種同時具有較高的富硒率和胞外多糖含量。

圖6 接菌量對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on selenium enrichment rates and extracellular polysaccharide content of lactic acid bacteria

2.4.4 培養(yǎng)溫度對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響

由圖7可知，溫度是微生物生長及代謝活動的重要因素[37]，不同的培養(yǎng)溫度對鼠李糖乳桿菌的富硒率和胞外多糖含量有所影響。鼠李糖乳桿菌生長的適宜溫度范圍為30～40 ℃，當溫度從33 ℃升至37 ℃時，菌株的富硒率和胞外多糖含量均顯著提升(P<0.05)且在37 ℃時達到最大值，分別為80.74%和51.26 μg/mL。在培養(yǎng)溫度較低時，菌體的活力下降，菌體的代謝能力弱，而當溫度高于37 ℃時，菌體的活力受到抑制，菌株的富硒率和胞外多糖含量下降。因此，選擇37 ℃為鼠李糖乳桿菌高富硒率和高產胞外多糖的溫度，確保菌種具有較高的活性。

圖7 培養(yǎng)溫度對乳酸菌富硒率及產胞外多糖的影響Fig.7 Effect of culture temperature on selenium enrichment rates and extracellular polysaccharide content of lactic acid bacteria

2.5 正交試驗結果

由表2可知，當以鼠李糖乳桿菌胞外多糖含量為評價指標時，由R1B>R1A>R1C>R1D可知，4種因素對其含量的影響主次順序為接菌量>培養(yǎng)時間>亞硒酸鈉質量濃度>培養(yǎng)溫度。由試驗組結果可知胞外多糖含量最高的組合為A2B2C3D1，理論值最優(yōu)組合為A2B2C1D3。通過表3比較可知，組合A2B2C1D3優(yōu)于組合A2B2C3D1，所以以胞外多糖含量為評價指標時的最優(yōu)組合為培養(yǎng)時間24 h，接菌量5%，亞硒酸鈉質量濃度10 μg/mL，培養(yǎng)溫度37 ℃。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 理論值與試驗值比較結果Table 3 Comparison of theoretical values and experimental values

當以鼠李糖乳桿菌富硒率為評價指標時，由R2A>R2B>R2D>R2C可知，4種因素對其富硒率影響的主次順序為培養(yǎng)時間>接菌量>培養(yǎng)溫度>亞硒酸鈉質量濃度。由試驗組結果可知富硒率最大的組合為A2B1C2D3，理論值最優(yōu)組合為A2B2C2D3。通過對比試驗結果可知，組合A2B2C2D3優(yōu)于A2B1C2D3，所以當以富硒率為評價指標時的最優(yōu)組合為培養(yǎng)時間24 h，接菌量5%，亞硒酸鈉質量濃度12.5 μg/mL，培養(yǎng)溫度37 ℃。由于試驗需要對比研究鼠李糖乳桿菌胞外含量多糖與其硒多糖結構等的差異，所以以富硒率為主要參考指標，探究硒元素對胞外多糖結構等的影響，選定A2B2C2D3為試驗條件進行后續(xù)試驗，即培養(yǎng)時間為24 h，接菌量為5%，亞硒酸鈉質量濃度為12.5 μg/mL，培養(yǎng)溫度為37 ℃，以不含亞硒酸鈉的發(fā)酵液所產的鼠李糖乳桿菌胞外多糖作為對照組，與硒多糖進行對比研究。

研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌經過硒化后的胞外多糖含量和富硒率在培養(yǎng)條件范圍內呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，這與陳營等[38]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在多糖高產量下菌體活性也最強，隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)基的pH降低，菌體活性減弱，結合多糖降解酶的作用，菌種多糖產量降低的結果相符。通過單因素和正交試驗得出的最佳試驗條件為培養(yǎng)時間24 h，接菌量5%，亞硒酸鈉質量濃度12.5 μg/mL，培養(yǎng)溫度37 ℃，而與實際試驗條件相比有誤差，這可能是由于乳酸菌多次傳代影響多糖產量有關。

3 結論

試驗選用了6種乳酸菌，由其生長曲線確定各菌的加硒時間，通過對比6種乳酸菌在不同亞硒酸鈉質量濃度下的顏色變化、富硒率變化和胞外多糖含量變化，選定鼠李糖乳桿菌作為最佳試驗菌種。通過單因素試驗確定了正交試驗的因素及水平，由正交試驗結果得到最佳試驗條件：培養(yǎng)時間24 h，接菌量5%，亞硒酸鈉質量濃度12.5 μg/mL，培養(yǎng)溫度37 ℃。此條件下，鼠李糖乳桿菌的富硒率為79.21%，胞外多糖含量為51.47 μg/mL。