腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后的關(guān)系

羅燕珍 周達(dá) 陳思靜 廖成成 王明月 譚曉虹 柯晴 岑洪

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuselarge B-cell lymphoma，DLBCL）是臨床上最常見的非霍奇金淋巴瘤病理亞型，目前臨床上廣泛使用國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）判斷DLBCL患者預(yù)后，但DLBCL是一組異質(zhì)性很大的疾病實體，IPI已不能滿足臨床需求［1］。因此，亟需開發(fā)新的預(yù)后指標(biāo)以指導(dǎo)臨床診療。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是腫瘤相關(guān)微環(huán)境的主要成分，在癌癥的起源以及發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。TAMs可通過產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo)血管生成，抑制抗腫瘤免疫激活，增強腫瘤細(xì)胞生長、侵襲能力，以及介導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生耐藥性和免疫逃逸［2］。目前常用的TAMs檢測方法，一是通過免疫組化法檢測腫瘤組織中CD68和CD163的表達(dá)，以評估腫瘤微環(huán)境中的TAMs水平［3］；二是通過基因表達(dá)譜分析來明確淋巴瘤組織中TAMs的浸潤水平。大量研究表明，高TAMs浸潤水平與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，但在DLBCL中，TAMs與患者預(yù)后的關(guān)系尚存在爭議［4-6］。隨著基因表達(dá)譜芯片廣泛用于臨床腫瘤研究，以及生物信息學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步，可通過現(xiàn)有的數(shù)據(jù)分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞成分的浸潤水平，探討其對腫瘤患者預(yù)后的影響及兩者內(nèi)在的生物學(xué)聯(lián)系［7］。本研究擬通過傳統(tǒng)免疫組化法檢測TAMs標(biāo)志物CD68、CD163的表達(dá)水平量化TAMs的浸潤水平，再利用生物信息學(xué)分析技術(shù)分析公共數(shù)據(jù)庫DLBCL相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中的M2型TAMs的含量，旨在探討DLBCL組織中TAMs浸潤水平與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。此外，利用ssGSEA分析TAMs中M2型浸潤水平與免疫相關(guān)信號通路的關(guān)系，進(jìn)一步探索其在DLBCL中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集2015年7月至2018年5月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院診治的95例DLBCL患者的臨床資料和組織石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴所有患者病理診斷至少由2位病理專家行組織學(xué)及免疫組化確診；診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO（2016年）對DLBCL亞型的診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵臨床資料完整，包括年齡、性別、有無B癥狀、血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）水平、美國東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分、結(jié)外累及情況、AnnArbor分期、有無大腫塊、有無骨髓受侵等；⑶均接受利妥昔單抗治療。排除合并其他腫瘤患者。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測CD68、CD163的表達(dá)水平

所有組織標(biāo)本用多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP）染色，嚴(yán)格按照說明書操作步驟檢測病理切片CD68、CD163的表達(dá)。兔抗CD163、CD68單克隆抗體購自Bioss公司。結(jié)果判讀：CD68、CD163主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)，染色陽性細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，且明顯高于背景。參照CENCINI等［8］評分及分組標(biāo)準(zhǔn)，首先在低倍鏡（×100）視野選取明顯著色區(qū)域，然后使用高倍鏡視野（×400）選取5個視野，連續(xù)計數(shù)CD163、CD68陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，根據(jù)陽性染色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例的平均值分為兩組：低浸潤組（＜25%），高浸潤組（≥25%）。所有病例均由2名病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲評估。

1.3 基因表達(dá)數(shù)據(jù)采集及分析

在GEO公共數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）搜索公開發(fā)表的DLBCL基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，篩選包含樣本量較大、臨床信息完整的GSE10846和GSE31312數(shù)據(jù)集，分別納入414例、469例樣本進(jìn)行分析?；贛2型TAMs對應(yīng)的基因表達(dá)特征，通過xCell算法（https：//xcell.ucsf.edu/）得出GSE10846和GSE31312數(shù)據(jù)集中每個癌癥樣本中M2型TAMs的相對浸潤水平，使用“survminer”R包surv_cutpoint函數(shù)獲取M2型TAMs浸潤水平對預(yù)后的最佳節(jié)點，并分為高浸潤組和低浸潤組，同時使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。采用GSVA（gene set variation analysis）R包進(jìn)行ssGSEA（single sample gene set enrichment analysis）分析，探索 M2型TAMs高浸潤及低浸潤水平在16條腫瘤相關(guān)免疫信號通路的富集情況，其中以P＜0.05和FDR＜0.25判定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的通路［9］。

1.4 隨訪

采用電話、門診或住院復(fù)查等方式隨訪。以患者確診日為隨訪起點，隨訪截至2019年9月，隨訪時間為4～50個月，中位隨訪時間為25個月。隨訪期間出現(xiàn)結(jié)局事件34例（35.7%），無失訪病例。無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）定義為確診至末次隨訪、疾病發(fā)生進(jìn)展或者死亡的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件、R 3.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分類資料組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析，并進(jìn)行Log-rank檢驗；采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析，以CD68+TAMs和CD163+TAMs高、低浸潤水平以及可能影響患者PFS的因素，如年齡、AnnArbor分期、有無B癥狀、LDH、ECOG評分、結(jié)外累及情況、有無骨髓受侵等作為協(xié)變量，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD68+TAMs、CD163+TAMs在DLBCL中的表達(dá)

免疫組化法檢測結(jié)果顯示，CD68、CD163主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)，呈棕黃色或者棕褐色。納入研究的95例患者中，CD68低表達(dá)50例（52.6%），高表達(dá)45例（47.4%），見圖1；CD163低表達(dá)34例（35.8%），CD163高表達(dá)61例（64.2%），見圖2。

圖1 DLBCL組織中CD68的表達(dá)（SP×400）Fig.1 Expression of CD68 in DLBCL tissues(SP×400)

圖2 DLBCL組織中CD163的表達(dá)（SP×400）Fig.2 Expression of CD163 in DLBCL tissues（SP×400）

2.2 CD68+TAMs、CD163+TAMs浸潤水平與DLBCL患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

CD68+TAMs浸潤水平與LDH水平、AnnArbor分期、骨髓受侵相關(guān)（均P＜0.05）；而與性別、年齡、B癥狀、β2-微球蛋白、ECOG評分、結(jié)外病變數(shù)量、有無大腫塊均無關(guān)（均P＞0.05）。CD163+TAMs浸潤水平與性別、年齡、B癥狀、LDH水平、β2-微球蛋白、ECOG 評分、結(jié)外病變數(shù)量、AnnArbor分期、有無大腫塊、骨髓有無受侵等均無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

表1 DLBCL組織中CD68+TAMs、CD163+TAMs浸潤水平與患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship between CD68+TAMs and CD163+TAMs infiltrating levels in DLBCL tissues and clinicopathological features of patients［n(%)］

2.3 CD68+TAMs、CD163+TAMs浸潤水平與DLBCL患者PFS的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示，95例DLBCL患者中，CD68+TAMs高浸潤組患者1年、3年P(guān)FS率分別為79.2%、55.4%，CD68+TAMs低浸潤組患者1年、3年P(guān)FS率分別為91.6%、74.6%，兩組PFS曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank χ2=4.127，P=0.042），見圖3A；CD163+TAMs高浸潤組患者1年、3年P(guān)FS率分別為82.9%、37.4%，CD163+TAMs低浸潤組患者1年、3年P(guān)FS率分別為90.9%、73.2%，兩組PFS曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=5.976，P=0.015），見圖3B。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，CD163+TAMs高浸潤是DLBCL患者預(yù)后的獨立危險因素（HR=2.695，95%CI：1.126～6.455，P=0.026），見表2。

表2 影響DLBCL患者預(yù)后的Cox回歸多因素分析Tab.2 Cox regression multivariable analysis of DLBCL patients

圖3 CD68+TAMs、CD163+TAMs浸潤水平與PFS的關(guān)系Fig.3 Relationship between CD68+TAMs and CD163+TAMs infiltrating levels and patients'PFS

2.4 GSE31312、GSE10846數(shù)據(jù)集中淋巴瘤組織M2型TAMs浸潤水平與患者總生存期的關(guān)系

根據(jù)“survminer”R包surv_cutpoint函數(shù)分別計算GSE31312、GSE10846基因數(shù)據(jù)集M2型TAMs浸潤水平，得出對預(yù)后的最佳節(jié)點，分別為0.1106、0.1336，據(jù)此將DLBCL患者分為高浸潤組與低浸潤組。GSE31312數(shù)據(jù)集中高浸潤組115例，低浸潤組354例；GSE10846數(shù)據(jù)集中高浸潤組62例，低浸潤組352例。2個數(shù)據(jù)集的生存分析顯示，M2型TAMs高浸潤與不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。見圖4。

圖4 GSE31312、GSE10846數(shù)據(jù)集中M2型TAMs浸潤水平與OS的關(guān)系Fig.4 Relationship between infiltration level of M2-type TAMs in GSE31312 and GSE10846 data sets and patients'OS

2.5 免疫相關(guān)信號通路在M2型TAMs高浸潤和低浸潤組的ssGSEA分析

分別對GSE31312和GSE10846數(shù)據(jù)集基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行ssGSEA免疫相關(guān)通路富集分析，觀察淋巴瘤組織中M2型TAMs高浸潤組與低浸潤組富集情況。結(jié)果顯示，GSE31312富集到6條通路有差異（均P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.25），GSE10846富集到9條通路有差異（均P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.25），其中2個數(shù)據(jù)集富集分析結(jié)果顯示，趨化因子信號通路、TCR信號通路、Ⅰ型干擾素信號通路、Treg分化信號通路、MHCⅠ類抗原呈遞信號通路、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通路均在低浸潤組中顯著富集。見圖5。

圖5 免疫相關(guān)信號通路在M2型TAMs低浸潤組的ssGSEA分析Fig.5 ssGSEA analysis of immune-related signaling pathways in the M2-type TAMs low infiltration group

3 討論

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用，而DLBCL是一種異質(zhì)性和侵襲性極高的惡性腫瘤，其微環(huán)境更復(fù)雜。巨噬細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子刺激下，主要極化為M1和M2兩種表型。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎因子如白介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-12、IL-23、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和各種趨化因子配體參與抗腫瘤炎癥免疫反應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞通過釋放高水平的IL-10、低水平IL-2，以及釋放血管生成因子、前列腺素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）而參與免疫抑制，增強腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力等。一般狹義的TAMs即指發(fā)揮免疫抑制及促瘤作用的M2型TAMs［2］。本研究通過免疫組化法檢測由 CD68、CD163標(biāo)記的TAMs在DLBCL組織中的浸潤情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD68+TAMs浸潤水平與LDH水平、AnnArbor分期、骨髓受侵相關(guān)，生存分析顯示，CD68+TAMs、CD163+TAMs高浸潤組患者的PFS率明顯低于低浸潤組，提示CD68+TAMs、CD163+TAMs與DLBCL預(yù)后有關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)CD163+TAMs高浸潤水平是DLBCL預(yù)后的獨立危險因素，而CD68+TAMs浸潤水平不是其獨立預(yù)后危險因素。以往研究關(guān)于CD68+TAMs在DLBCL中的作用尚存在爭議，如 HASSELBLOM等［10］發(fā)現(xiàn)CD68+TAMs浸潤水平與DLBCL預(yù)后不相關(guān)。而CAI等［11］發(fā)現(xiàn)CD68+TAMs高浸潤提示DLBCL患者不良預(yù)后；NAM等［12］在109例接受R-CHOP治療的DLBCL患者研究中發(fā)現(xiàn)CD68+TAMs高浸潤與較長的生存時間相關(guān)，而在56例僅接受CHOP治療的患者中表現(xiàn)為相反結(jié)果。分析造成各研究結(jié)果不一的可能原因是目前的研究樣本量有限。另外，CD68能標(biāo)記部分具有抗腫瘤作用的M1型巨噬細(xì)胞，其與表達(dá)CD68蛋白的M2型巨噬細(xì)胞功能相反，這也可能限制CD68+TAMs在預(yù)測DLBCL患者預(yù)后中的作用。而CD163主要在M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)，M1型巨噬細(xì)胞則不表達(dá)［13］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CD163+TAMs浸潤水平與DLBCL患者臨床病理特征均不相關(guān)，CENCINI等［8］研究也得出相似結(jié)果。同時，多數(shù)研究也認(rèn)為評估腫瘤組織CD163+TAMs的浸潤水平能更好地識別預(yù)后不良人群［14-15］，這也與本研究結(jié)果一致。隨著基因表達(dá)譜芯片廣泛用于臨床腫瘤研究，以及生物信息學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步，目前使用基于一組免疫特異性標(biāo)記基因或表達(dá)特征的計算方法可以從大量腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)中表征各種免疫細(xì)胞的浸潤水平，迄今為止，已有大量研究使用生物信息技術(shù)免疫浸潤分析方法探討腫瘤免疫細(xì)胞之間的關(guān)系及其對腫瘤患者預(yù)后的影響［16-17］。xCell是一種基于ssGSEA方法評估免疫細(xì)胞類型的豐度評分，其顯示出與真實細(xì)胞比例的高度相關(guān)性［18］。本研究為了進(jìn)一步驗證CD163+TAMs與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系，同時利用公共數(shù)據(jù)庫的2個DLBCL基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE10846、GSE31312）進(jìn)行分析，并基于M2型TAMs對應(yīng)的基因表達(dá)特征，利用xCell算法評估M2型TAMs的浸潤水平，也發(fā)現(xiàn)DLBCL組織中M2型TAMs高浸潤提示DLBCL患者預(yù)后不良。

在DLBCL微環(huán)境中，免疫效應(yīng)細(xì)胞、免疫抑制細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境之間是相互聯(lián)系、相互調(diào)節(jié)的整體，共同決定腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。NAM等［12］研究發(fā)現(xiàn)M2型TAMs與DLBCL預(yù)后和免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞浸潤水平有關(guān)。本研究基于xCell算法評估DLBCL組織中M2型TAMs浸潤比例，GSEA分析發(fā)現(xiàn)DLBCL組織中M2型TAMs浸潤水平與6條免疫信號通路相關(guān)，包括MHCⅠ類抗原呈遞信號通路、TCR信號通路、趨化因子信號通路、Treg分化信號通路、Ⅰ型干擾素信號通路、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通路。據(jù)研究報道，在腫瘤微環(huán)境中，M2型TAMs通過表達(dá)非經(jīng)典MHC-I分子、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4等分泌一系列細(xì)胞因子、趨化因子和酶，從而影響這些信號通路的激活，然后直接或間接抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能細(xì)胞活化［19］。KUSANO等［20］發(fā)現(xiàn)，DLBCL組織中CD4+T細(xì)胞浸潤低與患者不良預(yù)后相關(guān)。因此推測，在DLBCL中，M2型TAMs可能通過下調(diào)抗腫瘤炎癥反應(yīng)激活通路塑造利于腫瘤細(xì)胞生長與侵襲的免疫微環(huán)境。這一結(jié)果為DLBCL靶向TAMs的治療提供重要信息。但是，本研究僅在理論層面進(jìn)行分析，未來還需開展大量的基礎(chǔ)實驗進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明CD163+TAMs高浸潤是DLBCL患者預(yù)后的獨立危險因素，為其診斷、治療和構(gòu)建更好的預(yù)后評估系統(tǒng)提供新的思路。而CD68+TAMs與DLBCL的預(yù)后關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。此外，還發(fā)現(xiàn)TAMs可能通過下調(diào)抗腫瘤炎癥反應(yīng)激活通路塑造利于腫瘤細(xì)胞生長與侵襲的免疫微環(huán)境，這為研究免疫微環(huán)境在DLBCL中的作用機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。