m6A去甲基化酶ALKBH5在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義

鄭川軍 金松 吳紅梅 岑雪青 陸明深 譚盛葵 朱小年

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見的癌癥和第三大癌癥死因，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占75%～85%［1］。HCC發(fā)病隱匿，診斷時往往分期較晚，加之易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此預(yù)后較差。目前肝切除術(shù)、肝移植術(shù)、放療、化療、靶向治療等多種臨床治療手段聯(lián)合使用大幅提高了其臨床療效，但晚期患者的治療效果欠佳，遠期生存率并不理想。因此仍需繼續(xù)深入研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找特異性的診斷、治療和預(yù)后生物標志物，從而更有效地指導(dǎo)臨床治療決策制定，改善預(yù)后及降低死亡率。

m6A-甲基腺嘌呤（m6A-methyladenosine，m6A）甲基化是1974年首次發(fā)現(xiàn)的真核生物mRNA中最普遍的一種RNA修飾［2］。m6A修飾廣泛參與了RNA剪接、核輸出、翻譯及降解等一系列生物學(xué)過程，通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率影響多種病理生理進程［3］。烷基化修復(fù)蛋白 B 同源物 5（alkylation repair protein B homolog 5，ALKHB5）屬于ALKB雙加氧酶家族，是第二種被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物m6A去甲基化酶，同時也是另一種去甲基化酶脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO）的同源物［4-5］。ALKBH5主要通過m6A去甲基化參與mRNA的加工及降解來調(diào)節(jié)其輸出和穩(wěn)定性，在生殖發(fā)育［4］、成骨分化［6］、DNA損傷修復(fù)［7］等多種生物學(xué)過程中起著重要作用。m6A修飾是近年來腫瘤領(lǐng)域的研究熱點之一，而ALKBH5作為m6A修飾關(guān)鍵酶在腫瘤領(lǐng)域已進行了廣泛研究。已有文獻報道ALKBH5在肺癌［8］、膠質(zhì)瘤［9］、乳腺癌［10］等惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用，而在胰腺癌［11-12］、膀胱癌［13］、非小細胞肺癌［14］等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。然而，ALKBH5在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制目前尚不清楚。本研究采用免疫組化法檢測HCC組織中ALKBH5蛋白的表達情況，并結(jié)合臨床病理特征和隨訪資料進行分析，旨在探討其在HCC中的預(yù)后價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

采用回顧性隊列研究方法，收集2009年1月至2013年8月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院存檔的80例接受肝癌切除術(shù)的HCC患者癌組織及其癌旁組織（距病灶＞3 cm）石蠟包埋標本，由上海威奧生物科技有限公司制成組織微陣列芯片。所有患者均經(jīng)臨床和組織病理確診為HCC，術(shù)前未進行放化療，臨床病理資料完整。采用門診復(fù)查或電話方式隨訪患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況，每半年隨訪1次，隨訪截至2015年4月。總生存期（overall survival，OS）定義為手術(shù)當日至患者死亡或末次隨訪的時間，無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）定義為從手術(shù)當日至患者復(fù)發(fā)、死亡或末次隨訪的時間。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準（批件號：GLMC2014003），組織標本和臨床病理資料的獲取均征得患者及其家屬知情同意。

1.2 免疫組化法檢測ALKBH5蛋白的表達水平

組織微陣列芯片（每芯直徑1.5 mm）經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后，常規(guī)烘片、脫蠟、水化，以檸檬酸鹽修復(fù)緩沖液高壓修復(fù)抗原，3%過氧化氫溶液淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS緩沖液洗滌后在芯片上滴加山羊血清，室溫孵育30 min，以封閉非特異性結(jié)合位點；滴加稀釋的一抗ALKBH5（工作濃度1∶2 000，瑞士ATLAS ANTIBODIES公司），4℃孵育過夜；次日，滴加二抗（酶標抗小鼠/兔IgG聚合物）室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)分化、返藍、脫水干燥、封片固定。陰性對照采用PBS替代一抗。每個組織點在400倍鏡下隨機選取5個不同視野，記錄平均細胞染色強度（染色強度以多數(shù)細胞呈色為標準），計數(shù)細胞總數(shù)及陽性細胞數(shù)后計算陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比。免疫組化染色評分由本院兩名病理科醫(yī)師進行雙盲評定。半定量分析根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞百分比進行綜合評分。評分標準：⑴染色強度，未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；⑵陽性細胞百分比，陽性細胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。取兩項評分乘積作為最終染色得分，0～4分判定為低表達，＞4分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0（IBM SPSS，美國紐約州阿蒙克）軟件處理數(shù)據(jù)。采用McNemar檢驗比較HCC及癌旁組織中ALKBH5的表達，免疫組化評分分析選擇配對樣本t檢驗。χ2檢驗和多因素Logistic回歸分析ALKBH5表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較兩組生存曲線的差異。在 Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站（http：//www.kmplot.com/analysis/index.php?p=service）中選擇可公開獲取的數(shù)據(jù)集（有總生存資料的HCC患者364例，有無復(fù)發(fā)生存資料的HCC患者316例）進行在線生存分析。采用Cox回歸分析探討ALKBH5與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALKBH5在HCC組織及其癌旁組織中的表達

免疫組化染色結(jié)果顯示，ALKBH5蛋白主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜，見圖1。HCC組織中ALKBH5高表達的患者比例低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.429，P=0.001），見表1。HCC組織中ALKBH5染色得分低于癌旁組織（4.125±2.587vs5.475±3.284，t=3.456，P＜0.001），見圖2。

表1 ALKBH5在HCC組織及癌旁組織中的表達［n（%）］Tab.1 Expression of ALKBH5 in HCC tissues and adjacent tissues［n(%)］

圖1 ALKBH5在HCC組織及其癌旁組織中的染色情況（×400）Fig.1 Staining of ALKBH5 in HCC tissues and adjacent tissues(×400)

圖2 ALKBH5在HCC組織及其癌旁組織中的免疫組化評分（n=80）Fig.2 Immunohistochemistry scores of ALKBH5 in HCC tissues and adjacent tissues(n=80)

2.2 ALKBH5表達與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

單因素分析顯示，ALKBH5表達與腫瘤大小及復(fù)發(fā)相關(guān)（均P＜0.05），見表2。將單因素分析中P＜0.1的變量納入多因素Logistic回歸模型中，結(jié)果顯示ALKBH5蛋白表達與腫瘤大小（P=0.028）和血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平（P=0.019）有關(guān)，見表3。

表2 ALKBH5表達與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系［n(%)］Tab.2 The correlation between ALKBH5 expression and HCC clinicopathological features［n(%)］

表3 HCC中影響ALKBH5表達的多因素Logistic回歸分析Tab.3 Multivariable Logistic regression analysis of ALKBH5 expression in HCC

2.3 ALKBH5表達與HCC患者OS和RFS的關(guān)系

總體生存分析中，ALKBH5高表達組和低表達組的中位OS分別為41.0個月和16.5個月，3年OS率分別為52%和23%，ALKBH5高表達組患者組和低表達組患者的OS曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.486，P=0.011），見圖3A。ALKBH5高表達組中位RFS未達到，其3年RFS率為61%；ALKBH5低表達組的中位RFS為6.1個月，3年RFS率為25%。ALKBH5高表達組患者和低表達組患者的RFS曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.296，P=0.012），見圖3B。公共數(shù)據(jù)集生存分析結(jié)果顯示，ALKBH5高表達組患者的OS（P=0.015）及 RFS（P=0.002）均高于低表達組，見圖3C～D。

圖3 ALKBH5高表達和低表達HCC患者的OS和RFS曲線Fig.3 The OS and RFS curves of HCC patients with high and low expression of ALKBH5

2.4 HCC患者OS和RFS的單因素和多因素Cox回歸分析

將ALKBH5表達、腫瘤大小、復(fù)發(fā)、病理分級、血管侵犯和ALB水平等單因素分析中P＜0.1的變量納入多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型中進行分析。結(jié)果顯示ALKBH5低表達是影響HCC患者OS的獨立危險因素（HR=1.965，95%CI：1.029～3.751，P=0.041），見表 4。ALKBH5低表達是影響HCC患者RFS的獨立危險因素（HR=2.201，95%CI：1.046～4.629，P=0.038），見表5。

表4 HCC患者OS期的單因素和多因素Cox回歸分析Tab.4 Univariable and multivariable Cox regression analysis of OS of HCC patients

表5 HCC患者RFS的單因素和多因素Cox回歸分析Tab.5 Univariable and multivariate Cox regression analysis of RFS of HCC patients

3 討論

表觀遺傳調(diào)控中的異常如DNA甲基化、組蛋白甲基化和RNA甲基化等都是HCC發(fā)生的重要標志［15］。m6A修飾在惡性腫瘤包括HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，因此探索m6A修飾酶在HCC中的功能及作用機制對尋找潛在的預(yù)后標志物和有效的治療靶點以及制定針對m6A修飾酶的抗腫瘤治療策略具有重要意義?，F(xiàn)有文獻報道ALKBH5在不同類型腫瘤中發(fā)揮不同作用，但其是促癌基因還是抑癌基因尚未有統(tǒng)一結(jié)論。ZHANG等［9］研究顯示ALKBH5可通過去除轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）mRNA的m6A修飾上調(diào)其表達，從而促進膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的自我更新、增殖和腫瘤形成。ALKBH5是缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的直接靶標，在低氧條件下表達增強［16］。ZHANG等［10］在模擬缺氧條件下發(fā)現(xiàn)缺氧能刺激HIF-1α和HIF-2α表達，并增強了ALKBH5表達，然后通過m6A去甲基化上調(diào)胚胎干細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而促進乳腺癌腫瘤干細胞的濃縮富集，并提高其缺氧環(huán)境生存能力。在間歇性缺氧條件下，ALKBH5通過提高mRNA翻譯效率促進FOXM1表達而在肺腺癌中發(fā)揮促癌作用［8］。然而，YU 等［13］研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5可通過影響酪蛋白激酶2介導(dǎo)的糖酵解途徑抑制膀胱癌進展。在胰腺癌中，ALKBH5通過減少Wnt抑制因子-1（Wnt inhibitory factor-1，WIF-1）mRNA 上的 m6A修飾從而介導(dǎo)Wnt通路抑制腫瘤發(fā)生和上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進程［12］，或通過轉(zhuǎn)錄后激活生物鐘相關(guān)蛋白（period circadian regulator 1，PER1）抑制腫瘤進展［11］。還有研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5可以降低基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3（TIMP metallopeptidase inhibitor 3，TIMP3）mRNA穩(wěn)定性并促進非小細胞肺癌進展［17］。但另一研究認為ALKBH5可能通過減少轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）表達并抑制YAP蛋白活性，從而在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用［14］。上述研究說明，ALKBH5可能通過調(diào)節(jié)下游靶基因如轉(zhuǎn)錄因子、插頭蛋白等的m6A修飾，影響mRNA加工及降解而間接影響靶基因表達，從而在一定程度上影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，且ALKBH5依賴于特定的組織背景、腫瘤亞型和不同的下游分子而在各種癌癥中發(fā)揮抑癌或促癌作用。

目前關(guān)于ALKBH5在HCC中的表達及其作用，各研究中觀點也不一致。部分研究顯示ALKBH5在HCC中表達上調(diào)［18-19］，但也有研究報道ALKBH5在HCC中低表達［20-21］。CHEN 等［20］研究顯示，在HCC中ALKBH5通過m6A依賴的方式抑制含Ly6/PLAUR結(jié)構(gòu)域蛋白1（Ly6/PLAUR domain-containing protein 1，LYPD1）表達，從而抑制腫瘤的惡性行為。而QU等［22］研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5在乙型肝炎病毒相關(guān)HCC（HBV-HCC）患者中高表達，且與乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）形成正反饋環(huán)而促進HBV-HCC進展。以上研究說明了m6A介導(dǎo)HCC效應(yīng)的復(fù)雜性，也顯示ALKBH5在HCC中具有重要作用。本研究通過免疫組化法檢測HCC患者中ALKBH5蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)在HCC組織中ALKBH5表達低于癌旁組織，進一步結(jié)合臨床病理特征進行分析發(fā)現(xiàn)，相對于腫瘤大?。? cm以及AFP低水平的HCC組織，ALKBH5在腫瘤大小≥5 cm以及AFP高水平的HCC組織群體中表達降低。而腫瘤大小一般反映了腫瘤細胞的增殖能力，且既往研究在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)ALKBH5可抑制肝癌HepG2細胞的增殖能力［23］。說明ALKBH5低表達可能促進HCC細胞增殖及疾病進展。為了進一步明確ALKBH5對HCC患者預(yù)后的影響，本研究還進行臨床樣本生存分析，結(jié)果同樣顯示，相對于ALKBH5高表達患者，ALKBH5低表達患者的OS和RFS縮短，多因素Cox回歸分析也顯示ALKBH5低表達是HCC患者OS和RFS的獨立危險因素。利用在線數(shù)據(jù)集分析也得到一致結(jié)果，提示ALKBH5在HCC進展中發(fā)揮重要作用，但具體的作用機制仍不明確。目前多數(shù)癌癥研究著眼于ALKBH5的去甲基化作用，但ALKBH5也可能通過其他途徑影響癌癥表型。此外，m6A修飾受到多種調(diào)節(jié)因子的影響，因此未來需要進一步探討ALKBH5在HCC中通過m6A去甲基化調(diào)控的具體下游基因，以及其去甲基化作用在m6A修飾中的地位以及是否還存在其他分子機制可以解釋ALKBH5在HCC中的效應(yīng)。

綜上所述，ALKBH5在HCC組織中低表達，且與HCC患者預(yù)后不良相關(guān)，ALKBH5可能在HCC進展過程中具有潛在的腫瘤抑制作用，有望成為HCC患者預(yù)后判斷標志物及治療靶點。但由于本研究樣本量較小，仍存在一定局限性，如因納入TNM高分期、發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者例數(shù)較少，未觀察到這些重要臨床病理特征與預(yù)后的聯(lián)系。今后將進一步擴大樣本量并開展更加系統(tǒng)的體內(nèi)外實驗，進一步明確ALKBH5在HCC中的臨床意義、生物學(xué)功能及其作用機制。