miR-145-5p靶向調(diào)控LOX基因?qū)Ω伟┘?xì)胞侵襲和遷移的影響

邢婉婷 徐靜軒 齊魯楠

肝癌是全球第六大最常被診斷的癌癥，死亡率位居第四［1］。手術(shù)切除是肝癌的主要治療方法，然而術(shù)后復(fù)發(fā)率依然較高，而高復(fù)發(fā)率也是制約肝癌患者預(yù)后的主要原因。microRNA（miRNAs/miR）是長度為17～25個(gè)核苷酸的高度保守的非編碼小RNA［2］。既往研究顯示，miRNAs異常表達(dá)可通過mRNA降解和翻譯抑制參與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖以及惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等［3］。miRNA在肝癌中的作用也引起廣泛關(guān)注，miR-145-5p作為miRNA家族中重要的一員，目前也被發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤中具有抗腫瘤作用，包括肝細(xì)胞癌［4-6］。但miR-145-5p在肝癌中確切的作用及其機(jī)制仍不明確。賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）是一種分泌的銅依賴性單胺氧化酶，可對細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中可溶性膠原和彈性蛋白交聯(lián)的關(guān)鍵酶步驟進(jìn)行催化［7-8］。近年來越來越多的證據(jù)表明LOX在肝癌發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。在肝癌組織中LOX呈高表達(dá)，且LOX過表達(dá)能導(dǎo)致上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并與肝癌患者的高早期復(fù)發(fā)率和低總生存率相關(guān)［9-10］。還有研究報(bào)道，在富含腫瘤起始細(xì)胞的肝癌中，LOX過表達(dá)能通過增加血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力而部分激活血管生成［11］。因此，推測miR-145-5p可能通過靶向調(diào)控上游靶基因LOX而影響肝癌進(jìn)展。為此，本研究通過在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、SK-Hep1中探討miR-145-5p和LOX在肝癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用及其靶向調(diào)控機(jī)制，以期為靶向基因治療肝癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本、細(xì)胞系及主要試劑

收集2017年9月至2019年9月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的73例肝癌患者腫瘤組織及其相應(yīng)配對的鄰近正常組織樣本，所有腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為肝癌，并將切除的樣本立即置于-80℃冰箱中備用。本研究方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均提供書面知情同意書。

人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，人肝癌細(xì)胞系SK-Hep1購自上海中喬新舟生物科技有限公司。miR-145-5p慢病毒載體、LOX過表達(dá)質(zhì)粒、LOX慢病毒沉默載體均由吉?jiǎng)P基因科技有限公司（中國上海）提供。重組Anti-LOX抗體購自英國ABCAM公司，Anti-GAPDH抗體購自北京索萊寶科技有限公司。RNA提取試劑盒Total RNA Kit購自美國OMEGA公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR檢測試劑盒、Takara microRNA TB Green mix均購自日本Takara公司；SDS PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Matrigel膠購自美國BD公司；SYBGreen染料購自德國Roche公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、胰酶、青霉素雙抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、SK-Hep1均培養(yǎng)于含10% FBS的完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長至整個(gè)培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞，以1×106/mL濃度接種于6孔板中。根據(jù)LipofectamineTM3000試劑盒說明書分別轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒（pBABE組）以及空白載體（pBABE-NC組），以不做任何處理的細(xì)胞作為空白對照組（Control組）。

1.2.3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染 參考吉?jiǎng)P基因的慢病毒使用手冊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。取對數(shù)生長期SK-Hep1細(xì)胞，以5×104/mL濃度接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分組：將LOX沉默慢病毒轉(zhuǎn)染SK-Hep1細(xì)胞，記作sh組；轉(zhuǎn)染空白載體記作sh-NC組，以不做任何處理的細(xì)胞作為空白對照組（Control組）。另外分別將miR-145-5p mimics（mimics組）、mimics control（NC組）轉(zhuǎn)染SK-Hep1細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞SMMC-7721，以1×106/mL濃度接種于6孔板中，分別將miR-145-5p mimics（mimics組）、miR-145-5p inhibitor（inhibitor組）及其相應(yīng)空白載體轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞，同時(shí)設(shè)相應(yīng)空白對照組。

1.2.4 共轉(zhuǎn)染 分別將miR-145-5p mimics（mimics組）、mimics control（NC組）以及LOX過表達(dá)質(zhì)粒+miR-145-5p mimics（共轉(zhuǎn)染組）轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞，并按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 qRT-PCR檢測LOX和miR-145-5p表達(dá)水平

1.3.1 miRNA逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測 參照說明書操作步驟提取各組組織中的總RNA。按照Takara microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟操作合成cDNA，加A尾和RT反應(yīng)一步完成。按照Takara microRNA TB Green mix說明書進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃變性10 min，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 min，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-145-5p加尾法設(shè)計(jì)，CAGTTTTCCCAGGAATCCCTAA；U6作為內(nèi)參由Takara microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供。用2-△△Ct法計(jì)算miR-145-5p相對表達(dá)量。

1.3.2 LOX逆轉(zhuǎn)錄及PCR檢測 按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。熒光定量反應(yīng)體系20 μL，其中 SYBGreen 10 μL，F(xiàn)orward primer 0.6 μL，Reverse primer 0.6 μL，cDNA 模板 2 μL，無酶水加至 20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物序列：LOX（F）TTCTTACCCAGCCGACCAAGATA，（R）GTGTTGGCATCAAGCAGGTCA；β-Actin（F）CTGGAACGGTGAAGGTGA-CA，（R）CGGCCACATTGTGAACTTTG。用2-△△Ct法計(jì)算LOX相對表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測LOX表達(dá)水平

取轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，4℃下以12 000 r/min離心，提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，用10%SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用TBST緩沖液漂洗后，室溫封閉15 min。加入LOX抗體按1∶300稀釋作為一抗，4℃孵育過夜。次日將PVDF膜置于1∶2 500稀釋的GAPDH抗體中，室溫下孵育3 h。然后采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力

遷移實(shí)驗(yàn)：用純DMEM培養(yǎng)基重懸各組細(xì)胞（密度為500/μL）。將100 μL細(xì)胞懸液接種至24孔板Transwell小室上室中，下室加入含10%FBS的600 μL完全培養(yǎng)基作為趨化劑。每組細(xì)胞重復(fù)2個(gè)孔，做好標(biāo)記，密封條包好后在37℃、5% CO2潮濕環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。16 h后取出，用1 mL甲醇固定30 min，0.5 mL 0.1%結(jié)晶紫染色20 min，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。侵襲實(shí)驗(yàn)中預(yù)先將Matrigel基質(zhì)膠和DMEM培養(yǎng)基按照1∶8比例稀釋并包被Transwell小室上室，待其凝固后，接種細(xì)胞懸液。除培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整為36 h外，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6 miR-145-5p靶基因預(yù)測及其功能分析

通過生物信息學(xué)技術(shù)TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）對差異表達(dá)的miR-145-5p的可能靶基因進(jìn)行預(yù)測，利用Cluster Profiler包對預(yù)測的差異表達(dá)miR-145-5p靶基因交集進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析。其中GO功能注釋富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三個(gè)方面。對miR-145-5p可能的靶基因在以上三方面的富集結(jié)果按照從大到小排序，用GraphPad Prism 5.0繪制GO富集分析，R軟件4.0.2繪制KEGG生物通路富集分析結(jié)果的氣泡圖，采用Benjamini-Hochberg法矯正P值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-145-5p和LOX在肝癌組織中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-145-5p在癌旁正常組織中的表達(dá)高于肝癌組織（4.196±2.288 vs 2.835±1.817，P＜0.0001），見圖1A；LOX在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織（12.17±1.369 vs 11.26±1.556，P＜0.001），見圖1B。

圖1 miR-145-5p和LOX在肝癌組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-145-5p and LOX in liver cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 LOX對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

用Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別檢測過表達(dá)LOX對SMMC-7721細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，及沉默LOX對SK-Hep1細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，結(jié)果顯示，與Control組和pBABE-NC組比較，pBABE組中SMMC-7721細(xì)胞侵襲和遷移個(gè)數(shù)增加（P=0.011，P＜0.001），見圖2A、C；與Control組和sh-NC組比較，沉默LOX組（sh組）SK-Hep1細(xì)胞侵襲和遷移個(gè)數(shù)明顯減少（均P＜0.001），見圖2B、D。說明敲低LOX能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力，過表達(dá)LOX增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力。

圖2 過表達(dá)和沉默LOX對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.2 Effects of overexpression and silencing of LOX on migration and invasion of liver cancer cells

2.3 miR-145-5p對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與NC組和Control組比較，轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimics的SK-Hep1細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)均減少（均P＜0.001），見圖3A；與NC和Control組比較，轉(zhuǎn)染 miR-145-5p inhibitor組的SMMC-7721細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)均明顯增加（均P＜0.001），見圖3B。說明過表達(dá)miR-145-5p抑制了肝癌細(xì)胞SK-Hep1的侵襲和遷移能力，沉默miR-145-5p則促進(jìn)了肝癌細(xì)SMMC-7721的侵襲和遷移能力。

圖3 過表達(dá)和沉默miR-145-5p對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effects of overexpression and silencing of miR-145-5p on migration and invasion of liver cancer cells

2.4 LOX能逆轉(zhuǎn)miR-145-5p抑制的肝癌細(xì)胞侵襲和遷移

TargetScan 7.0數(shù)據(jù)庫分析顯示，LOX基因的3'-UTR區(qū)與miR-145-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimics的SMMC-7721細(xì)胞中LOX的表達(dá)水平降低（P＜0.001），而轉(zhuǎn)染miR-145-5p inhibitor能明顯升高LOX的蛋白表達(dá)水平（P＜0.001），見圖4B；與mimics組比較，共轉(zhuǎn)染組SMMC-7721細(xì)胞中LOX蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.001），見圖4C。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與mimics組比較，共轉(zhuǎn)染組中SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均增加（P＜0.001），見圖4D～E。說明miR-145-5p能抑制LOX蛋白表達(dá)水平，LOX過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-145-5p對SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲的抑制能力。

圖4 LOX過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-145-5p對SMMC-7721細(xì)胞侵襲和遷移的抑制能力Fig.4 Overexpression of LOX reversed the inhibitory ability of miR-145-5p on migration and invasion of SMMC-7721 cells

2.5 miR-145-5p的靶基因功能分析

用TargetScan獲取miR-145-5p所有靶基因，再用Cluster Profiler包進(jìn)行GO功能注釋富集分析，分別從生物過程、細(xì)胞組分、分子功能三方面進(jìn)行GO功能注釋富集分析（圖5A）并按照大小排序，結(jié)果顯示，miR-145-5p靶基因與小GTP酶結(jié)合、Ras GTP酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、GTP酶調(diào)節(jié)活性、核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)活性、肌動(dòng)蛋白結(jié)合酶激活劑活性、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等緊密相關(guān)。細(xì)胞組分富集分析顯示miR-145-5p的靶基因與細(xì)胞前緣、黏著斑、細(xì)胞-基底連接、細(xì)胞-細(xì)胞連接、突觸后特化作用、突觸后密度、不對稱突觸、神經(jīng)元間突觸、谷氨酸能突觸、細(xì)胞皮層等有關(guān)。生物過程富集分析發(fā)現(xiàn)miR-145-5p靶基因參與GTPase活性調(diào)節(jié)、GTPase活性正性調(diào)節(jié)、細(xì)胞連接組件、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生調(diào)控、軸突生成、胚胎器官發(fā)育、阿米巴型細(xì)胞遷移以及細(xì)胞-基質(zhì)黏附等過程。

圖5 miR-145-5p靶基因的GO和KEGG富集分析結(jié)果Fig.5GO and KEGG enrichment analysis of miR-145-5p target genes

使用Cluster Profiler包對預(yù)測的miR-145-5p靶基因集合進(jìn)行KEGG生物通路富集分析，對miR-145-5p靶基因富集的通路進(jìn)行排序匯總，其中位于前10的參與信號通路包括MAPK信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、（細(xì)胞）內(nèi)吞作用、軸突導(dǎo)向、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、黏附連接、Rap1信號通路、耶爾森菌感染、FoxO信號通路、TGF-β信號通路。見圖5B。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的進(jìn)化過程，受腫瘤前體和抗腫瘤因子共同調(diào)控［12］。既往研究顯示多種miRNAs可以通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與腫瘤的生物學(xué)行為，在腫瘤診斷和預(yù)后中均具有重要作用［13］。異常表達(dá)的miRNA可以作為原癌基因或腫瘤抑制基因影響多種惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移［14］。多項(xiàng)研究也報(bào)道了miR-145-5p在不同癌癥類型中異常表達(dá)，并顯示出抗腫瘤作用［15-16］。如在胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)miR-145-5p可通過靶向MUC13抑制細(xì)胞侵襲和遷移［17］；在口腔鱗狀細(xì)胞癌中通過調(diào)控c-Myc和CDK6發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［18］；在子宮內(nèi)膜癌［19］和黑色素瘤［20］也發(fā)揮了抑制細(xì)胞侵襲和遷移作用。在肝癌中，盡管有研究證實(shí)miR-145-5p表達(dá)下調(diào)［21］，但其作用機(jī)制尚不清楚。LOX是一種銅依賴性單胺氧化酶，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，近年來，越來越多的研究表明LOX家族參與了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控，且可作為調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄因子［22］。但是，LOX在肝癌中的研究機(jī)制并不全面，為了探索miR-145-5p是否通過調(diào)控LOX而在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用，本研究首先采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測LOX對肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LOX能增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力，而沉默LOX則抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中miR-145-5p具有抑制細(xì)胞侵襲、遷移能力，并且這種能力可通過上調(diào)LOX表達(dá)逆轉(zhuǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的關(guān)系，本研究還進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LOX mRNA的3'-UTR區(qū)與miR-145-5p有結(jié)合位點(diǎn)；且Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-145-5p對肝癌細(xì)胞中的LOX表達(dá)水平具有一定調(diào)控作用；qRT-PCR檢測結(jié)果也顯示大多數(shù)HCC患者癌旁組織中miR-145-5p mRNA的表達(dá)水平高于相應(yīng)癌組織，而LOX則相反，提示miR-145-5p可能為上游調(diào)控LOX的一個(gè)關(guān)鍵miRNA。此外，本研究還通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-145-5p的靶基因并找出了與miR-145-5p在生物過程、細(xì)胞組分、分子功能三個(gè)方面的作用。但是，本研究未進(jìn)行雙熒光免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LOX是否為miR-145-5p的結(jié)合靶點(diǎn)，有待今后進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-145-5p在肝癌組織中低表達(dá)，而LOX則高表達(dá)，miR-145-5p可能通過負(fù)向調(diào)控LOX抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，因此miR-145-5p的升高或抑制可能是一種潛在的治療策略。本研究初步探索了miR-145-5p通過靶向LOX抑制肝癌惡性生物學(xué)行為，研究結(jié)果有望為肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的診療提供新思路。