細(xì)胞DNA圖像自動(dòng)分析技術(shù)（DNA-ICM）在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值

姚 瓊，劉秀芬，盛友華

上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院病理科，上海 201499

據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年公布的全球癌癥數(shù)據(jù)，我國每年宮頸癌的發(fā)病數(shù)約11萬，占全球?qū)m頸癌發(fā)病數(shù)的18.2%，每年死亡病例數(shù)約為5.9 萬例，占全球?qū)m頸癌死亡病例數(shù)的17.3%。

絕大多數(shù)宮頸癌都與人乳頭瘤病毒（HPV）感染有關(guān)，HPV DNA 檢測是一種較為直接且有效的篩檢方法，但敏感性高而特異性不足，同時(shí)由于HPV E6/E7 與宿主細(xì)胞核整合過程中部分病例會(huì)丟失HPV DNA 而造成假陰性；而細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查常常受人為因素的影響，降低了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

細(xì)胞DNA 圖像自動(dòng)（掃描）分析技術(shù)（DNAICM）是建立在基因水平上的檢測方法。研究表明，細(xì)胞DNA 倍體異常是遺傳基因、染色體變異的標(biāo)志，對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷與分流、細(xì)胞增殖能力、癌前病變的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等都有客觀的臨床參考價(jià)值［1-2］。

隨著DNA-ICM 作為宮頸癌篩查方法的不斷應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)DNA 異倍體不僅出現(xiàn)在宮頸上皮內(nèi)病變/宮頸癌中，在良性反應(yīng)性改變內(nèi)也會(huì)出現(xiàn)相當(dāng)比例的異倍體；同時(shí)在宮頸病變（甚至是癌）雖然細(xì)胞學(xué)出現(xiàn)明顯異型性，但其染色體DNA 倍體卻沒有異常改變。因此，本課題擬運(yùn)用DNA-ICM、Ki-67 免疫細(xì)胞化學(xué)、HPV 檢測方法對(duì)結(jié)果綜合分析，探討DNA-ICM在宮頸癌篩查中的作用與應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院2018 年婦科宮頸?？崎T診宮頸癌篩查標(biāo)本，其中10 例DNA 含量均為二倍體的正常宮頸組織作為對(duì)照組，192 例作為實(shí)驗(yàn)組：無上皮內(nèi)病變或惡性病變（NILM） 69 例、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL） 30例、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL） 65 例、鱗形細(xì)胞癌（SCC） 28 例，年齡21～76歲，平均（42.2±11.4）歲。

1.2 DNA-ICM測定和DNA指數(shù)（DI）的計(jì)算方法

DNA 染色套裝及分析掃描儀均來源于武漢呵爾醫(yī)療科技發(fā)展有限公司。對(duì)沉降法液基細(xì)胞制片儀制作的細(xì)胞涂片F(xiàn)eulgen 染色后DNA-ICM 分析，通過DI 來確定細(xì)胞倍體異常。DI=被測細(xì)胞DNA IOD 值/正常細(xì)胞DNA（G0/G1 期）IOD 平均值，以DI≥2.5為異倍體判讀標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)

Ki-67 試劑盒（克隆號(hào)MIB1，檢測濃度1∶100）來源于廈門通靈生物醫(yī)藥科技有限公司，采用EnVisionTM二步法，EDTA 熱修復(fù)。以細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色著色為陽性標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞重疊或抱團(tuán)不計(jì)數(shù)。

1.4 HPV檢測方法及分型分組

采用PCR+導(dǎo)流雜交法。所用試劑來源于潮州凱普生物化學(xué)有限公司。根據(jù)HPV 的遺傳特性和致瘤性的差異，將HPV 亞型分成三組：低危組（6、11、42、43、44、CP8304）、中危組（31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）及高危組（16、18）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。采用Pearsonχ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA-ICM及HPV檢測結(jié)果

DNA-ICM 及 HPV 篩 查SIL+ 的 靈 敏 度 為65.9%、84.6% （χ2=34.217，P<0.001），特 異 度 為72.5%、55.1%（χ2=10.340，P= 0.006），組間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

表1 DNA-ICM及HPV篩查SIL+的靈敏度、特異度Tab. 1 Sensitivity and specificity of DNA-ICM and HPV screening for SIL+

2.2 NILM、LSIL、HSIL、SCC 的DI 閾值及少量異倍體細(xì)胞數(shù)（≤2個(gè)）、平均個(gè)數(shù)、Ki-67平均陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)

NILM、LSIL、HSIL、SCC 的DI 閾值分別為≤4、≤4、≤6、≤5，其中3 例HSIL、2 例SCC 出現(xiàn)DI>4，提示DI>4 對(duì)HSIL 及SCC 具有診斷價(jià)值意義；少量（≤2個(gè)）異倍體細(xì)胞的占比10.1%（7/69）、33.3%（10/30）、26.1%（17/65）、28.6%（4/28），顯示在各級(jí)病變中甚至是癌都可以是少量個(gè)別的異倍體；異倍體細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)分別為0.9、3.9、9.4、12.0，Ki-67 的陽性細(xì)胞平均個(gè)數(shù)3.1、10.5、88.6、255.6，組間具有顯著性差異（χ2=14.680，P<0.05），顯示隨著病變進(jìn)展，異倍體細(xì)胞和Ki-67陽性細(xì)胞平均數(shù)量均表現(xiàn)為逐級(jí)增多（表2，圖1、2）。

圖1 DNA倍體分析、細(xì)胞形態(tài)學(xué)涂片及病理組織染色結(jié)果Fig. 1 DNA ploidy analysis， cell morphology smear， and pathological tissue staining results

表2 宮頸病變的DI 閾值及異倍體細(xì)胞數(shù)（≤2 個(gè)）、平均個(gè)數(shù)、Ki-67平均陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)Tab. 2 DI threshold， few （≤2） and mean number of anploid cells， and mean number of Ki-67 positive cells in cervical lesions

A、B、C 為同一NILM 病例，DI 指數(shù)從大到小排列在1.615～1.250 之間，A 示DNA 倍體分析未見倍體異常，B示細(xì)胞學(xué)巴氏染色（高倍），C示組織學(xué)HE染色（高倍）；D、E、F 為同一SCC 病例，DNA DI 指數(shù)從大到小排列在4.274 與2.139 之間，D 示異倍體細(xì)胞17 個(gè)，未見多核瘤巨細(xì)胞，E 示巴氏染色細(xì)胞涂片內(nèi)見多核瘤巨細(xì)胞（高倍），F(xiàn)示組織學(xué)HE 染色癌細(xì)胞顯著異型性，呈浸潤性生長（高倍）。

2.3 HPV亞型的異倍體檢出率。

在HPV 低、中、高危型組異倍體的檢出率分別為12.1%、57.5%、82.3%，組間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=43.420，P<0.001），表明DNA 異倍體細(xì)胞的檢出率及數(shù)量增加與HPV致瘤危險(xiǎn)性一致（表3）。

表3 HPV亞型分組中異倍體細(xì)胞的檢出率［n（%）］Tab. 3 Detection rate of anploid cells in HPV subtype groups ［n（%）］

3 討論

研究表明，DNA-ICM 對(duì)細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)和DNA 含量進(jìn)行定量分析，對(duì)于宮頸癌及癌前病變?cè)\斷具有較好的臨床參考價(jià)值［3］，通過結(jié)合液基細(xì)胞學(xué)檢測可以提高宮頸癌和癌前病變的篩查陽性率，降低漏診率［4］，同時(shí)聯(lián)合P16/Ki-67雙染能有效提高宮頸癌確診率，輔助ASC-US的分流診斷［5］。

圖2 異倍體細(xì)胞平均個(gè)數(shù)、Ki-67陽性細(xì)胞平均數(shù)Fig. 2 Average number of anploid cells and Ki-67 positive cells

本實(shí)驗(yàn)組DNA-ICM 及HPV 篩查SIL+的靈敏度為65.9%、84.6% （χ2=34.217，P<0.001，特 異 度 為73.9%、52.2%（χ2=10.340，P= 0.006），組間均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，作為同樣的定性和/或定量客觀檢測指標(biāo)，DNA-ICM 篩檢宮頸病變的特異度明顯高于HPV檢測法，而靈敏度則明顯低于HPV檢測。

69 例NILM 的異倍體細(xì)胞的檢出平均數(shù)量為0.9 個(gè)，對(duì)于其中伴中、高危HPV 感染且異倍體的檢出數(shù)量增多則提示上皮細(xì)胞持續(xù)的HPV 感染和異常增殖風(fēng)險(xiǎn)，由于細(xì)胞倍體先于細(xì)胞形態(tài)變化，可有助于區(qū)別所謂的“一過性感染”，因此DNA 異倍體可作為評(píng)估具有向更高級(jí)病變轉(zhuǎn)化的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測因子。如圖1A、B、C 所示無上皮內(nèi)病變或惡性病變中異倍體細(xì)胞的出現(xiàn)除與HPV 的感染因素相關(guān)外，宮頸慢性活動(dòng)性炎癥所誘導(dǎo)的反應(yīng)性增生、不成熟鱗化等也會(huì)導(dǎo)致倍體變化甚至異倍體細(xì)胞產(chǎn)生，這可能與上皮內(nèi)炎細(xì)胞浸潤所釋放的炎癥因子干擾并加速了正常增殖周期的進(jìn)程。

30 例LSIL、65 例HSIL、28 例SCC 的異倍體細(xì)胞的檢出平均個(gè)數(shù)分別為3.9、9.4、12.0，異倍體數(shù)量較好地反映了病變的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，隨著癌前病變的進(jìn)展，DNA 異倍體細(xì)胞數(shù)也逐步增多以及宮頸上皮內(nèi)病變完成了DNA由量變到癌的質(zhì)變過程。

為提高細(xì)胞DNA 倍體檢測的特異性，國內(nèi)外有較多文獻(xiàn)忽略個(gè)別（1～2 個(gè)）出現(xiàn)的DNA 異倍體或者把DI 值提高到≥4.5 作為細(xì)胞病理臨床診斷的陽性標(biāo)準(zhǔn)。本組LSIL、HSIL、SCC 出現(xiàn)個(gè)別（≤2）異倍體的占比為10.1%、33.3%、26.1%、28.6%，可見在各級(jí)病變中都存在個(gè)別的異倍體，說明在HSIL甚至癌與NILM、LSIL 一樣也可能存在個(gè)別而不是出現(xiàn)大量的異倍體的情況，因此不能單從細(xì)胞數(shù)量定義癌變風(fēng)險(xiǎn)，可能與腫瘤細(xì)胞生長周期（G0/G1→S→G2/M期）在增殖動(dòng)力學(xué)上存在運(yùn)行阻滯相關(guān)。

NILM、LSIL、HSIL、SCC 的DNA 異倍體DI 閾值分別為≤4、≤4、≤6、≤5，其中3 例HSIL、2 例SCC 的DI>4。因此宮頸癌篩查中可以DI>4 作為細(xì)胞病理高級(jí)別以上病變?cè)\斷指標(biāo)，雖然靈敏度低，但是特異度好，同時(shí)DI>4 的HSIL 則可能存在惡性進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn)，無論異倍體細(xì)胞數(shù)的多少或細(xì)胞學(xué)有無檢出異常都要予以密切重視。

本實(shí)驗(yàn)組在33 例低危型HPV 樣本中DNA 異倍體檢出率為12.1%，在73 例中危型樣本中DNA 異倍體檢出率為57.5%，在62 例高危型樣本中DNA 異倍體檢出率為82.35%，組間存在顯著性差異（χ2=43.420，P<0.001）。HPV 病毒基因整合是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的直接原因，HPV 病毒基因E6/E7 通過感染宮頸上皮并與染色體整合，使得DNA 倍體發(fā)生異常改變，因此DNA倍體和HPV檢測同樣可以預(yù)示病變的發(fā)展進(jìn)程及病變程度。在低危HPV也存在12.1%的DNA 異倍體檢出率，說明在宮頸癌細(xì)胞診斷體系中HPV不整合也可以導(dǎo)致細(xì)胞的DNA倍體異常，異倍體細(xì)胞的產(chǎn)生不等同于致癌的高風(fēng)險(xiǎn)。而對(duì)于中、高危HPV 感染引起DNA 倍體異常，特別是異倍體細(xì)胞數(shù)量的顯著增多且異倍體峰形成則可能存在致瘤高風(fēng)險(xiǎn)，無論有無細(xì)胞或組織學(xué)異常都應(yīng)該加以密切隨訪。

Ki-67 是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，可以識(shí)別除G0期外的G1、S、G2、M 期的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示NILM、LSIL、HSIL、SCC異倍體細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)分別為0.9、3.9、9.4、12.0，Ki-67 的陽性細(xì)胞平均個(gè)數(shù)分別為3.1、10.5、88.6、255.6，兩組檢測組間具有顯著性差異（χ2=14.680，P<0.05）。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出DNA 異倍體細(xì)胞的檢出數(shù)與Ki-67 陽性細(xì)胞數(shù)存在著相關(guān)性，隨著病變進(jìn)展，DNA 異倍體細(xì)胞數(shù)與Ki-67陽性細(xì)胞平均數(shù)均呈上升趨勢。從量化數(shù)據(jù)提示盡管DNA 異倍體與Ki-67 相似，都是反映細(xì)胞的增殖活性，但異倍體細(xì)胞的出現(xiàn)可能反映的是細(xì)胞增殖S-G2/M 期的DNA 異常變化。如圖1D、E 所示，由于DNA-ICM 對(duì)重疊和抱團(tuán)細(xì)胞不能切割分析，所以相應(yīng)只對(duì)游離散在的Ki-67 陽性上皮細(xì)胞作計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

綜上所述，細(xì)胞DNA 異倍體的產(chǎn)生是宮頸癌發(fā)生中的早期事件，DNA 指數(shù)（DI）反映了細(xì)胞周期中的DNA 含量和/或結(jié)構(gòu)變化或異常，可以明顯提高宮頸細(xì)胞學(xué)的診斷率，減少漏診率和誤診率，輔以Ki-67 免疫組織化學(xué)提高上皮內(nèi)病變的診斷和分型。DNA異倍體的數(shù)量和DI閾值對(duì)細(xì)胞學(xué)的診斷、增殖的活躍度評(píng)估及病變的進(jìn)展都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。