CLK與相關(guān)疾病的研究進(jìn)展

司文英，孟憲勇，董曉華

(1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

CLK家族是一組進(jìn)化上保守的雙特異性激酶，能夠磷酸化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上的蛋白底物，改變蛋白質(zhì)底物的生理特性，從而在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到關(guān)鍵作用。CLK通過對富含絲氨酸和精氨酸(serine-and arginine-rich，SR)結(jié)構(gòu)域的蛋白進(jìn)行磷酸化，調(diào)控pre-mRNA的選擇性剪接。異常磷酸化與許多人類疾病有關(guān)，近年來研究表明CLK與病毒感染、腫瘤、藥物成癮及神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，現(xiàn)對CLK在抗病毒、抗腫瘤、藥物成癮以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用進(jìn)行綜述。

1 CLK家族的生理功能

CLK屬于蛋白質(zhì)激酶的一個(gè)小亞家族，包括CLK1、CLK2、CLK3和CLK4。最初在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了CLK1基因，認(rèn)為它是一種與長壽相關(guān)的基因，在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)CLK1突變會(huì)使其壽命延長。CLK1在包括人類在內(nèi)的真核生物中是保守的，其結(jié)構(gòu)與酵母代謝調(diào)節(jié)劑Cat5p/Coq7p相似，CLK1突變體壽命延長可能是其細(xì)胞代謝減慢的結(jié)果[1]。已有研究通過廣泛的自磷酸化證實(shí)CLK1和CLK3的激酶結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中以活性形式表達(dá)。CLK1和CLK3的催化結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)典型的蛋白激酶折疊，C端展示了一種獨(dú)特而保守的“EHLAMMERILG”特征基序，CLK也因此被稱為“LAMMER”激酶[2]。人類CLK基因由13個(gè)外顯子組成，可選擇性剪接表達(dá)全長或缺失催化結(jié)構(gòu)域的截短蛋白。至少有兩種剪接機(jī)制可導(dǎo)致截短的CLK1表達(dá)：外顯子4的跳躍和內(nèi)含子保留。CLK1的N端截?cái)鄬?dǎo)致CLK1酶活性急劇增加，表明N端起負(fù)調(diào)控作用[3-4]。

CLK1在細(xì)胞周期進(jìn)程中是必不可少的[5]，CLK2參與褐色脂肪組織中飲食誘導(dǎo)的產(chǎn)熱控制，是肝臟糖異生的抑制因子，而CLK3在成熟精子中大量表達(dá)，可能在受精過程中發(fā)揮作用。此外，CLK對生理溫度變化的敏感性是由激酶激活片段內(nèi)的結(jié)構(gòu)重排所賦予的[6]。CLK作為體溫傳感器，全局控制選擇性剪接和基因表達(dá)。CLK的C端激酶結(jié)構(gòu)域本身對溫度敏感，并且該特征在不同哺乳動(dòng)物中保持不變。

2 CLK與病毒感染

流感病毒感染會(huì)造成季節(jié)性流行病和反復(fù)發(fā)生的大流行，對全球公共健康構(gòu)成威脅。流感病毒屬于正黏病毒科，其核蛋白(nucleoprotein，NP)和基質(zhì)蛋白M1的抗原差異使流感病毒可以分為A型、B型和C型。A型病毒進(jìn)一步分型基于血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)表面糖蛋白的抗原性。病毒的高突變率促進(jìn)了其突變體的產(chǎn)生，使得針對病毒編碼目標(biāo)的疫苗和藥物可能無效。相反，將宿主細(xì)胞決定因子作為目標(biāo)，可以防止病毒逃逸。已有研究證實(shí)CLK1是甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)在體外和體內(nèi)成功復(fù)制所必需的[7]。CLK1的選擇性剪接豐富了基因組和蛋白質(zhì)組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中涉及的多種蛋白質(zhì)異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)和功能變異性。流感病毒利用宿主RNA加工機(jī)制啟動(dòng)選擇性剪接，使CLK1與SR蛋白的RNA識別序列結(jié)合，調(diào)控IAV M基因的剪接變體(M2)RNA的合成，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)組的多樣性表達(dá)[8-9]。有報(bào)道稱抑制CLK1基因的表達(dá)可以使流感病毒復(fù)制減少兩個(gè)數(shù)量級以上，與病毒M2 mRNA剪接受損有關(guān)[10]。因此，CLK1被認(rèn)為是治療流感病毒的潛在宿主細(xì)胞靶點(diǎn)。

CLK1被發(fā)現(xiàn)影響COS-1細(xì)胞中腺病毒E1A基因選擇性剪接[11]。CLK家族成員在調(diào)控HIV-1基因表達(dá)和RNA加工中的作用不同，CLK1過表達(dá)可增加HIV-1感染的HeLa細(xì)胞中Gag蛋白的表達(dá)，而CLK2過表達(dá)則抑制Gag[12]。CLK1對基孔肯雅病毒的有效復(fù)制至關(guān)重要[13]。

3 CLK與腫瘤

3.1 CLK與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的耐藥性

神經(jīng)膠質(zhì)瘤占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%以上，是迄今為止成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤。神經(jīng)膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最具侵襲性的膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方式主要是手術(shù)切除并輔助化療，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性成為限制其預(yù)后的最大障礙[14]。CLK1是一種線粒體酶，其表達(dá)減少會(huì)影響線粒體功能。線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突變在腫瘤細(xì)胞化療耐藥性中發(fā)揮重要作用[15]。近年來有研究探索腫瘤細(xì)胞中沉默CLK1與化療藥物耐藥性之間的關(guān)系，結(jié)果表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中減少CLK1表達(dá)可以抑制AMPK的磷酸化，進(jìn)而激活下游mTOR信號通路，mTOR活化后可在基因和蛋白水平上調(diào)HIF-1α，提高糖酵解能力，抑制線粒體功能，通過Bcl-2家族抑制細(xì)胞凋亡，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性增加[16]。

3.2 CLK與乳腺癌

乳腺癌是最常見的癌癥，也是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因。C-myc在多種人類癌癥中過表達(dá)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、代謝和凋亡等過程，其表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。Myc調(diào)控pre-mRNA剪接，因此我們可以使用剪接調(diào)節(jié)劑作為抗癌藥物，治療Myc介導(dǎo)的癌癥。有研究表明CLK2和Myc協(xié)同調(diào)節(jié)pre-mRNA的生物合成和剪接加工，以提高癌細(xì)胞的存活率。富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子1(serine and arginine-rich splicing factor 1，SRSF1)是CLK的直接底物，也是Myc的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在Myc介導(dǎo)的乳腺癌中，一種新型口服CLK2抑制劑(T-025)可誘導(dǎo)外顯子跳躍突變，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞數(shù)量減少。相反，CLK2過表達(dá)嚴(yán)重影響Myc擴(kuò)增的乳腺癌患者的生存，而對非Myc擴(kuò)增的乳腺癌患者的生存僅有輕微影響。CLK家族激酶在Myc驅(qū)動(dòng)的乳腺癌中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[17-18]。

三陰乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，即雌激素、孕激素受體和人表皮生長因子受體-2的表達(dá)均為陰性的乳腺癌。癌細(xì)胞中CLK2的缺失導(dǎo)致上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，表明CLK2可被用于調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞剪接模式和抑制乳腺腫瘤的生長[19]。

3.3 CLK與肝細(xì)胞癌

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，發(fā)病率高。與非腫瘤對照組相比，CLK3在HCC組織中明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與HCC惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。下調(diào)CLK3表達(dá)可在體外抑制肝癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲，在體內(nèi)則抑制腫瘤發(fā)展。CLK3是miR-144的直接靶點(diǎn)，在HCC中miR-144的表達(dá)與CLK3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)miR-144可顯著抑制CLK3的表達(dá)，而過表達(dá)CLK3可部分逆轉(zhuǎn)miR-144對肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，表明調(diào)控CLK3的表達(dá)可用于肝癌的診斷和治療[20]。

3.4 CLK與膽管癌

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，臨床上較少見。我國膽管癌患者數(shù)量較多，因此膽管癌的研究在我國具有特殊意義。CCA患者CLK3表達(dá)顯著上調(diào)，被認(rèn)為主要與核苷酸代謝重編程有關(guān)。CLK3使USP13在Y708位點(diǎn)磷酸化，促進(jìn)USP13與c-Myc結(jié)合，從而阻止FBXL14介導(dǎo)的c-Myc泛素化，激活嘌呤代謝基因的轉(zhuǎn)錄。CCA相關(guān)CLK3-Q607R突變體誘導(dǎo)USP13-Y708磷酸化并增強(qiáng)c-Myc活性；反之，c-Myc上調(diào)CLK3的表達(dá)。CLK3表達(dá)水平與人類CCA標(biāo)本中phospho-USP13-Y708、c-Myc和嘌呤合成途徑中的關(guān)鍵酶ATIC的表達(dá)顯著相關(guān)。鹽酸他克林已被證實(shí)可抑制異常CLK3增強(qiáng)的CCA侵襲性，這為含有CLK3突變的CCA提供了一種新的可行性治療策略[21]。

3.5 CLK與其他腫瘤

CLK2過表達(dá)可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的增殖，其作用機(jī)制可能與NSCLC中miR-573表達(dá)減少有關(guān)[22]。一種新型腫瘤抑制劑SM08502可通過抑制CLK的活性來降低Wnt通路基因表達(dá)，抑制胃腸道腫瘤細(xì)胞生長[23]。另一種CLK抑制劑T3可以與Bcl-xL/Bcl-2抑制劑協(xié)同作用，誘導(dǎo)人卵巢癌A2870細(xì)胞和直腸癌HCT116細(xì)胞凋亡，使CLK抑制劑聯(lián)合Bcl-xL/Bcl-2抑制劑為癌癥治療新選擇[24]。此外，CLK還與胰腺癌、前列腺癌有關(guān)。

4 CLK與藥物成癮

藥物成癮是一種強(qiáng)迫性用藥的疾病，可引起嚴(yán)重的公共健康和社會(huì)問題。藥物成癮與突觸可塑性、獎(jiǎng)賞機(jī)制、學(xué)習(xí)記憶、感覺和認(rèn)知等領(lǐng)域有關(guān)。多巴胺(dopamine，DA)是大腦中參與獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在藥物成癮中發(fā)揮重要作用。多巴胺降解通過兩種方式，一種是酶降解，通常由單胺氧化酶介導(dǎo)；另一種是多巴胺通過多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter，DAT)跨質(zhì)膜易位。鈣介導(dǎo)的囊泡與突觸前膜融合導(dǎo)致多巴胺釋放到突觸間隙，質(zhì)膜DAT利用突觸間隙和突觸前神經(jīng)元之間的離子梯度來驅(qū)動(dòng)多巴胺的運(yùn)輸[25]。鐵作為機(jī)體中一種重要的元素，參與機(jī)體諸多生理過程。機(jī)體中鐵穩(wěn)態(tài)受鐵離子外排蛋白(ferroportin1,FPN1)調(diào)節(jié)，而鐵調(diào)素(hepcidin)可以與FPN1結(jié)合，降解FPN1。CLK1的缺失可以導(dǎo)致線粒體呼吸鏈中電子傳遞受阻、線粒體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加和HIF-1α表達(dá)上調(diào)[26-27]。HIF-1α與hepcidin結(jié)合抑制hepcidin的轉(zhuǎn)錄，hepcidin對FPN1的降解減少，細(xì)胞內(nèi)鐵離子外排增加，鐵離子濃度降低可抑制蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，從而抑制DAT降解，因此突觸間隙的DA濃度降低[28]可以抑制獎(jiǎng)賞系統(tǒng)介導(dǎo)的藥物成癮。

5 CLK與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

5.1 CLK與阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)也稱為老年性癡呆，是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶喪失、認(rèn)知障礙、行為改變，并且多伴有人格改變。AD的特征性病理改變主要包括β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque，SP)和tau蛋白(tubulin-associated unit)過度磷酸化行成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)，隨著社會(huì)老齡化程度的不斷加劇，AD已成為當(dāng)今社會(huì)的主要醫(yī)療衛(wèi)生問題之一[29]。

CLK1是生物合成泛醌(ubiquinone，UQ)所必需的，UQ是線粒體電子傳遞鏈中的電子載體，此外還可以作為抗氧化劑發(fā)揮作用。Mclk1(小鼠的同源基因)的完全缺失導(dǎo)致小鼠死亡，但Mclk1+/-突變的小鼠壽命延長。在Mclk1+/-突變體中，線粒體外膜中的UQ越多，內(nèi)膜中的UQ越少。UQ減少導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS生成增多。有文獻(xiàn)報(bào)道線粒體ROS生成增加有助于延長壽命[30]。最近幾年的深入研究表明年齡是影響老年人認(rèn)知功能減退和AD的最大危險(xiǎn)因素。線粒體活性下降與年齡相關(guān)功能障礙的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[31]。有研究表明，與正常對照組相比，AD患者的尸檢結(jié)果表明AD的病理過程中存在線粒體功能障礙[32]。綜上，線粒體功能障礙可以提高生物體的適應(yīng)性和存活率，超過閾值就會(huì)產(chǎn)生毒性，生存能力也會(huì)受到影響[33]。

AD病因尚不明確，且目前尚無有效的治療方法。有研究者在AD患者前額葉和海馬的SP和NFTs中檢測到大量鐵離子，提示鐵離子可能參與了這些病理特征的形成。氯碘羥喹(clioquinol，CQ)作為一種金屬螯合劑，與鐵離子螯合可阻斷Aβ的聚集，還可以調(diào)控tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵酶GSK-3，阻止tau蛋白過度磷酸化。此外，CQ對神經(jīng)退行性疾病的多種細(xì)胞和動(dòng)物模型以及AD患者具有有益效果，其作用機(jī)制與抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中CLK1的活性有關(guān)。氯碘羥喹抑制哺乳動(dòng)物中CLK1的活性，這種作用可被鐵或鈷離子阻斷，說明螯合過程參與了CQ對CLK1的作用，但確切機(jī)制尚不清楚[34-36]。PBT2，一種基于氯碘羥喹化學(xué)結(jié)構(gòu)的新型8-羥基喹啉，AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型經(jīng)過11天的PBT2治療，小鼠的認(rèn)知功能得到一定程度的恢復(fù)。在Ⅱa臨床試驗(yàn)期，研究人員對78例AD患者進(jìn)行了12周的PBT2治療，發(fā)現(xiàn)PBT2可以降低腦脊液中的Aβ水平，且降低程度與PBT2用藥量有關(guān)[34]。CLK1抑制劑氯碘羥喹及其衍生物有望成為治療AD的潛在藥物。

5.2 CLK與帕金森病

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種以運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)表現(xiàn)為特征的神經(jīng)系統(tǒng)特發(fā)性疾病。它是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生在老年人群。PD的病理生理學(xué)改變包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退化和路易小體的形成[37]。CLK1是自噬通路中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，絲氨酸/蘇氨酸激酶mTOR調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和增殖，是自噬的主要負(fù)調(diào)控因子。AMPK激活調(diào)節(jié)線粒體功能維持能量平衡來保護(hù)神經(jīng)元存活。CLK1可以調(diào)節(jié)AMPK/mTORC1通路，損害自噬-溶酶體通路，促進(jìn)體內(nèi)和體外多巴胺能神經(jīng)元損傷[38]。此外有文獻(xiàn)報(bào)道，在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中減少CLK1表達(dá)后，小鼠大腦黒質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，同時(shí)發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，炎癥因子釋放增加，HIF-1α的表達(dá)上調(diào)，表明CLK1基因表達(dá)下調(diào)通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎癥因子，作用于周圍的多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)元變性和壞死，從而加重PD的癥狀[39]。因此，調(diào)節(jié)CLK1的活性可能是一種潛在的治療PD的新方法。

6 CLK與遺傳性疾病

Phelan-McDermid綜合征(Phelan-McDermid syndrome，PMDS)是一種由22號染色體長臂末端缺失引起的先天性疾病，同時(shí)伴有SHANK3基因缺失，這種缺失與智力殘疾和自閉癥有關(guān)。最近的一項(xiàng)研究表明，抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶CLK2可以修復(fù)SHANK3缺失的神經(jīng)元突觸缺陷，并且CLK2抑制劑使SHANK3基因缺陷的小鼠恢復(fù)了正常的社交能力。因此，研發(fā)新型CLK2抑制劑有望改善PMDS患者的自閉癥[40]。

7 CLK與骨關(guān)節(jié)疾病

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種全關(guān)節(jié)疾病，其特征為軟骨退化、骨質(zhì)改變和滑膜炎癥，導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙狹窄、疼痛和功能喪失，是全球殘疾的三大原因之一。Wnt通路抑制劑Lorecivivint可抑制CLK2介導(dǎo)的SR蛋白的磷酸化，抑制CLK2的表達(dá)，可促使早期軟骨的形成[41]；另一個(gè)Wnt通路抑制劑SM 04755對CLK2的作用導(dǎo)致Wnt通路受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞的分化，減輕炎癥反應(yīng)，作用于CLK2靶點(diǎn)后促使膠原酶誘導(dǎo)的大鼠肌腱損傷的修復(fù)[42]。因此，CLK2有望成為治療OA和肌腱病的新靶點(diǎn)。

8 小 結(jié)

綜上，CLK可通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、剪接因子與病毒感染、腫瘤、藥物成癮及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近些年，隨著CLK的分子機(jī)制研究取得巨大進(jìn)展，為治療和尋找新的臨床藥物提供了新方向和新思路。CLK在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如AD的治療中有很好的前景，現(xiàn)已有部分CLK抑制劑被證實(shí)是治療AD的潛在藥物，但還處于臨床試驗(yàn)階段。進(jìn)一步了解CLK在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)展過程中的作用，可為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。