玉竹多糖對D-半乳糖誘導A7r5細胞衰老的保護作用

李明慧，侯俊宇，胡 迪，劉 靜，趙夢丹，葛俊宏，申 野，李 坦，彭鈺博，劉 鵬 ，孫 新,

（1.北華大學基礎醫(yī)學院，吉林吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林吉林 132013；3.北華大學藥學院，吉林吉林 132013；4.北華大學公共衛(wèi)生學院，吉林吉林 132013；5.北華大學口腔醫(yī)學院，吉林吉林 132013）

隨著人口老齡化的增加，探索衰老的相關分子機制已成為現(xiàn)代科學研究的一個重要研究熱點[1-2]。衰老是由氧化應激[3]引起或在正常條件下生物發(fā)育成熟后，一個緩慢的自身機能減退以及結構和功能逐漸退化的過程[4-5]。衰老過程中，細胞形態(tài)變化與分子水平改變往往漸進性影響健康，因此衰老與疾病和死亡密切相關[6]。大多數(shù)正常細胞的分裂能力是有限的，細胞停止分裂后就進入衰老狀態(tài)，因此衰老細胞被認為是機體衰老的重要原因[7]。

玉竹（Polygonatum odoratum），為百合科黃精屬多年生植物的干燥根莖，呈圓柱形，種類各異。為我國傳統(tǒng)中藥材，并記載在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。玉竹主要化學成分包括多糖、類固醇、蒽醌、生物堿、皂苷、維生素等[8]，已被證明在治療與年齡有關的疾病如糖尿病、肺病、疲勞和消化不良的臨床實踐中非常有效，玉竹不僅具有藥用價值，還具有食用價值，被列為藥食同源性物品[9-10]。許多中草藥中的多糖成分已被證明具有抗衰老活性，并引起抗衰老領域專家越來越大的興趣[11]。多糖是玉竹根中最主要的活性成分，目前有很多關于玉竹多糖（Polygonatum odoratumpolysaccharides，POP）的藥理作用、自由基清除及其抗氧化活性的研究[12-14]。李化強等[15]研究表明POP對DPPH·、、·OH和均有一定的清除作用。彭壯等[16]通過實驗證實POP能夠改善D-半乳糖（D-gal）誘導的衰老模型小鼠認知障礙，改善海馬區(qū)的病理狀態(tài)。POP還可通過miRNA-1224的Hippo信號通路抑制破骨細胞生成[17]。但關于POP的體外抗衰老及線粒體膜電位保護作用的研究較為少見。

本研究應用水提醇沉的方法提取POP，并用Sevag法去除多糖中的蛋白質。應用D-gal作用于大鼠胸大動脈平滑肌細胞（A7r5）建立細胞衰老模型，研究POP對D-gal誘導A7r5細胞衰老的保護作用，為POP的抗衰老基礎研究及抗衰老食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉竹干燥根莖 長白山特色植物種植地；大鼠胸大動脈平滑肌細胞（A7r5） 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；乙醇 遼寧泉瑞試劑有限公司；氯仿 天津凱信化學工業(yè)有限公司；苯酚、硫酸、正丁醇 國藥集團化學試劑有限公司；D-氨基半乳糖胺（D-gal）北京金泰宏達生物科技有限公司；DMSO、維生素E（VE） 美國 Sigma公司；MTT 美國 Amresco公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清 美國Gibco公司；胰蛋白酶 美國Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞衰老β半乳糖苷酶（SA-β-gal）試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 碧云天生物科技有限公司。

Z323K低溫高速離心機、Infinite M200 PRO酶標儀 美國Beckman公司；TDL-5-R低速離心機上海安亭科學儀器廠；EZ585臺式凍干機 美國SIM公司；MCO-18AICUVL-PC二氧化碳培養(yǎng)箱日本Panasonic公司；MDF-U4086S -80 ℃超低溫冰箱 日本SANYO公司；CLRSS II TYPE B2超凈工作臺 北京HDL公司；TH4-200倒置熒光顯微鏡、FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 POP的提取與純化 目前提取POP的方法有超聲波輔助法、超聲波輔助酶法、水提醇沉法等。其中超聲波輔助法可破壞植物細胞的細胞壁易影響多糖結構[18-19]。本實驗采用簡單、易操作、提取率高的水提醇沉法提取玉竹粗多糖，經(jīng)查閱多篇文獻，現(xiàn)已確定水提醇沉法提取黑龍江源POP可獲得最佳提取率為7.93%，其選擇的提取條件為溫度80 ℃，時間2 h，固液比1:15 g/mL[20]。在本研究中，在該條件基礎上進行多次預實驗，優(yōu)化POP提取條件，發(fā)現(xiàn)POP提取條件在料液比為1:20 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時間為2.5 h條件下進行煎煮，可得到最佳提取率，故我們選用該條件進行POP的提取。首先稱取玉竹根莖300 g，研磨打碎，按上述實驗條件進行提取，反復三次后合并三次的提取液，而后進行濃縮至700 mL。將濃縮液3500 r/min離心10 min，去除沉淀。用分液漏斗緩慢滴入無水乙醇直至乙醇含量達到90%。4 ℃冰箱靜置過夜，次日取出后3500 r/min離心，去上清，沉淀物用無水乙醇洗脫，干燥后得到玉竹粗多糖。

將玉竹粗多糖溶于蒸餾水中配置成5%的糖溶液，放置于-80 ℃冰箱過夜，次日取出置于水浴箱中溶解，12000 r/min離心棄沉淀，反復凍融直至無沉淀離出。將氯仿和正丁醇以4:1的比例配制混合液進行Sevag，取多糖溶液與氯仿、正丁醇混合液按1:4混合，震蕩 1 h，4000 r/min離心 15 min，此時離心管內(nèi)會出現(xiàn)三層，上層為糖溶液，中間層為變性蛋白，下層為有機試劑，收取最上層的糖溶液，反復Sevag直至無變性蛋白析出。把Sevag后的糖溶液加入3500 Da的透析袋中，置于流水下24 h，最后將透析24 h后的多糖溶液收集到平皿中，在22 mT、-102.8 ℃條件下凍干，得到POP。POP得率計算公式：

式中：M1為提取出的POP的質量，g；M2為玉竹原材料質量，g。

1.2.2 POP總糖含量測定 本實驗應用苯酚-硫酸法測定POP中總糖含量，目前已有研究測量其含量為75.23%[21]。首先配制葡萄糖標準液使其濃度為100 μg/mL，然后將其稀釋為 0、10、20、40、60、80、100 μg/mL濃度梯度的葡萄糖溶液，分別取葡萄糖標準液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于試管中，用蒸餾水定容至1 mL，將POP配制成100 μg/mL的糖溶液1 mL，在不同濃度梯度的葡萄糖溶液及POP溶液中依次加入6%苯酚溶液0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，振蕩，沸水浴10 min，然后冷卻至室溫，490 nm處測得吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，計算POP中總糖含量。

1.2.3 A7r5細胞活力測定

1.2.3.1 POP對A7r5細胞增殖的影響 將含有10%FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細胞后，以5000 cells/孔接種于96孔板中，設置對照組，25、50、100、200、400、800 μg/mL POP處理組，每組6個平行實驗，置于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。次日用上述濃度梯度的POP溶液處理細胞24 h。然后每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)箱孵育4 h后去除上清，每孔加入150 μL DMSO，置于酶標儀上混勻，490 nm處測得吸光度值，細胞存活率計算公式：

式中：A處理組為不同濃度POP處理后測得的吸光度值；A對照組為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞測得的吸光度值。

1.2.3.2 D-gal對A7r5細胞增殖的影響 將含有10%FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細胞后，以5000 cells/孔接種于96孔板中，根據(jù)查閱文獻得到D-gal致細胞衰老模型的適宜濃度梯度[22-23]，對本實驗的處理濃度及處理時間進行條件摸索。設置對照組，5、10、20、40、80 mg/mL D-gal處理組，每組6個平行實驗，至于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。次日用上述濃度梯度的D-gal處理細胞24和48 h。然后每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)箱孵育4 h后去除上清，每孔加入150 μL DMSO，置于酶標儀上混勻，490 nm處測得吸光度值，細胞存活率計算公式：

式中：A處理組為不同濃度D-gal處理后測得的吸光度值；A對照組為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞測得的吸光度值。

1.2.3.3 POP對D-gal處理A7r5細胞增殖的影響將含有10% FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細胞后，以5000 cells/孔接種于96孔板中，設置對照組、D-gal模型組、POP處理組，每組6個平行實驗。置于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。待細胞長到適宜的密度后，首先用25、50、100、200、400、800 μg/mL POP 處理細胞 5 h后，將模型組和處理組同時加入D-gal使其濃度達到40 mg/mL，放入培養(yǎng)箱孵育48 h。然后每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)箱孵育4 h后去除上清，每孔加入150 μL DMSO，置于酶標儀上混勻，490 nm處測得吸光度值，細胞存活率計算公式：

式中：A處理組為不同濃度POP處理組及D-gal模型組測得的吸光度值；A對照組為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞測得的吸光度值。

1.2.4 POP對D-gal誘導A7r5細胞內(nèi)指標的影響

1.2.4.1 A7r5細胞內(nèi)SA-β-gal活性的測定 將含有10% FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細胞后，以1.1×105cells/孔接種于6孔板中，設置對照組、D-gal模型組、POP處理組和VE陽性對照組，每組3個平行實驗。至于37 ℃、5%CO2培育箱孵育過夜。次日先用100 μg/mL POP和100 μg/mL VE處理細胞5 h后，將模型組、POP處理組和陽性對照組同時加入D-gal使其濃度達到40 mg/mL，放入培養(yǎng)箱孵育48 h。然后用β-半乳糖苷酶染色試劑盒進行染色，首先用PBS清洗1次，加入染色固定液每孔1 mL，37 ℃、5% CO2培育箱固定15 min，然后用PBS清洗3次，每次3 min，清洗完畢后加入染色液 A 10 μL/孔、染色液 B 10 μL/孔、染色液 C 930 μL/孔、X-Gal溶液 50 μL/孔，而后將培養(yǎng)皿封閉放入無CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。倒置熒光顯微鏡對細胞進行拍照，以評估POP對D-gal誘導A7r5細胞內(nèi)SA-β-gal活性的影響。

1.2.4.2 A7r5細胞產(chǎn)生活性氧（ROS）的測定 為檢測D-gal誘導A7r5細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，應用ROS試劑盒進行染色。細胞培養(yǎng)方法同1.2.4.1。將處理后細胞中的培養(yǎng)液去除，加入PBS清洗1次，以1:2000的比例用無血清的DMEM稀釋DCFH-DA，每孔加入1 mL DCFH-DA稀釋液使其細胞表面充分覆蓋，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min后去除稀釋液，用無血清的DMEM清洗3次，3 min/次。熒光顯微鏡觀察各組細胞染色的熒光強度，研究POP對ROS產(chǎn)生的影響。

1.2.4.3 A7r5細胞線粒體膜電位的測定 為了檢測POP對D-gal誘導A7r5細胞線粒體膜電位變化的影響，采用線粒體膜電位試劑盒（JC-1）以JC-1為熒光探針檢測細胞的線粒體膜電位變化。將6孔板內(nèi)每孔滴入200 μL培養(yǎng)液，將高壓滅菌后的蓋玻片緩慢放入6孔培養(yǎng)皿中使蓋玻片與培養(yǎng)皿底部貼合，培養(yǎng)A7r5細胞后，以11×104cells/孔接種于6孔板中，每孔緩慢滴入2 mL細胞培養(yǎng)液。設置對照組、D-gal模型組、POP處理組和VE陽性對照組，每組3個平行實驗。至于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。次日先用 100 μg/mL POP 和 100 μg/mL VE處理細胞5 h后，將模型組、處理組和陽性對照組同時加入D-gal使其濃度達到40 mg/mL，放入培養(yǎng)箱孵育48 h。然后用線粒體膜電位試劑盒進行染色，首先PBS清洗1次，加入1 mL培養(yǎng)液再加入1 mL JC-1染色工作液，充分混合后放入CO2培養(yǎng)箱孵育20 min，然后用JC-1染色緩沖液（×1）4 ℃冰浴洗滌2次，最后每孔加入2 mL培養(yǎng)液，將有細胞覆蓋的蓋玻片用針頭取出，封片在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)進行處理與統(tǒng)計學分析應用GraphPad Prism 6.01，試驗結果均為3次平行試驗所得，數(shù)據(jù)以均值±標準差（±SD）表示，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 POP的提取及測定

300 g玉竹根莖按照料液比為1:20 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時間為2.5 h條件下煎煮濃縮，醇沉、sevag提取POP共24.68 g，POP得率為8.23%。

苯酚-硫酸法測得POP總糖含量，根據(jù)葡萄糖標準曲線，得到線性回歸方程y=0.007x+0.0162，R2=0.9923。POP濃度為 100 μg/mL時吸光度為 0.52，根據(jù)公式得POP的總糖含量為76.48%±0.036%。

2.2 POP對A7r5細胞增殖的影響

MTT檢測POP對A7r5細胞活力的影響，如圖1，實驗表明 25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL濃度梯度的POP處理A7r5細胞24 h后，POP呈劑量依賴性提高細胞活力，促進細胞增殖，當濃度為400 μg/mL時，POP對A7r5細胞促增值作用最強，細胞存活率為 174.89%±3.30%（P＜0.001，n=3）。

圖1 POP對A7r5細胞存活率的影響Fig.1 Effect of POP on the survival of A7r5 cells

2.3 D-gal對A7r5細胞增殖的影響

MTT實驗表明，圖2A為不同濃度D-gal處理A7r5細胞24 h，與對照組相比，80 mg/mL D-gal刺激A7r5細胞24 h，細胞存活率約為56.95%±2.78%（P＜0.001，n=3）。圖2B為不同濃度 D-gal處理A7r5細胞48 h，與對照組相比，40 mg/mL D-gal刺激A7r5細胞48 h細胞存活率約為65.93%±1.63%（P＜0.001，n=3）。D-gal呈劑量依賴性誘導 A7r5 細胞存活率下降。考慮到D-gal濃度過高會導致細胞凋亡或死亡的不可逆性損傷，此時的細胞損傷量是研究體外細胞衰老的最適劑量與時間。因此，本實驗選用40 mg/mL D-gal處理48 h進行構建A7r5細胞衰老模型。

圖2 D-gal對A7r5細胞存活率的影響Fig.2 Effect of D-gal on the survival of A7r5 cells

2.4 POP對D-gal處理A7r5細胞增殖的影響

MTT實驗結果表明，如圖3，與對照組相比，D-gal組誘導 A7r5 細胞存活率下降（P＜0.001，n=3）；與D-gal組相比，在加入25～800 μg/mL濃度梯度的POP 5 h后，加入 40 mg/mL D-gal處理 48 h后，均可促進細胞增殖。濃度為100 μg/mL時POP對D-gal誘導A7r5細胞存活率下降的保護作用最為顯著，細胞存活率為 226.87%±12.58%（P＜0.001，n=3）。因此，本實驗選用濃度為100 μg/mL的POP及相應濃度的VE陽性對照進行后續(xù)細胞染色的研究。

圖3 POP對D-gal誘導A7r5細胞存活率下降的影響Fig.3 Effect of POP on D-gal-induced decline of A7r5 cell viability

2.5 POP對A7r5細胞內(nèi)SA-β-gal產(chǎn)生的影響

對D-gal及POP處理A7r5細胞后所產(chǎn)生的衰老相關SA-β-gal進行檢測，如圖4A～D為對照組、模型組、陽性對照VE組（100 μg/mL）、POP 組（100 μg/mL）細胞的 SA-β-gal染色情況，圖4E 為 SA-β-gal染色陽性細胞計數(shù)分析。染色結果表明，與對照組相比經(jīng)D-gal處理的模型組SA-β-gal表達水平明顯增加，SA-β-gal染色陽性細胞百分比為81.33%±8.17%（P＜0.001，n=3）。100 μg/mL POP 處理組及 VE陽性對照組處理后，圖4C～D中SA-β-gal催化下生成的藍色產(chǎn)物明顯減少，SA-β-gal染色陽性細胞百分比分別為44.67%±2.49%、39.67%±2.05%。實驗結果表明，D-gal誘導細胞發(fā)生衰老，且POP有效降低了D-gal刺激A7r5細胞產(chǎn)生SA-β-gal的表達情況（P＜0.01，n=3）。

圖4 POP對D-gal誘導的A7r5細胞產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的影響作用Fig.4 Effect of POP on the production of β-galactosidase in A7r5 cells induced by D-gal

2.6 POP對D-gal誘導A7r5細胞產(chǎn)生ROS的抑制作用

如圖5A～D為對照組、模型組、陽性對照VE組（100 μg/mL）、POP 組（100 μg/mL）細胞的 ROS 熒光染色情況，圖5E為ROS染色的熒光強度細胞計數(shù)分析，與對照組相比，模型組中陽性細胞數(shù)增多，ROS染色陽性細胞熒光強度為75.15%±3.70%（P＜0.001，n=3）熒光強度明顯增強。結果表明A7r5細胞經(jīng)D-gal處理后ROS水平升高。與模型組相比，VE陽性對照組和POP處理組中細胞染色陽性細胞數(shù)減少，ROS染色陽性細胞熒光強度分別為27.41%±1.96%、25.41%±2.58%，熒光強度明顯下調(diào)（P＜0.001，n=3）。細胞內(nèi)的酯酶可以將本身沒有熒光的探針DCFH-DA水解。活性氧可將水解產(chǎn)物DCFH氧化為有熒光的DCF，從而利用熒光強度反應活性氧水平。實驗結果表明，POP可以有效抑制D-gal誘導的A7r5細胞中ROS的表達水平。

圖5 POP對D-gal誘導的A7r5細胞中ROS水平的影響Fig.5 Effect of POP on the level of ROS in A7r5 cells induced by D-gal

2.7 POP對A7r5細胞線粒體膜電位的影響

應用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）對D-gal刺激A7r5細胞的線粒體膜電位變化進行檢測。如圖6A～D為對照組、模型組、陽性對照VE組（100 μg/mL）、POP組（100 μg /mL）、圖6E為 JC-1染色的熒光強度細胞計數(shù)分析。通過共聚焦顯微鏡檢測JC-1時可以參考觀察其它熒光時的設置，通過PI通道可觀察到聚合物（JC-1 aggregates）紅色熒光，F(xiàn)ITC通道可觀察到JC-1單體（JC-1 monomer）綠色熒光。并對不同通道的紅綠熒光進行Merge。通過紅綠熒光顏色的轉變可知線粒體膜電位的變化。染色結果表明，與對照組相比，經(jīng)D-gal處理的模型組JC-1染色的紅色熒光強度為18.74%±2.96%（P＜0.001，n=3），此時JC-1多為單體，綠色熒光強于紅色熒光，表明線粒體膜電位降低。與模型組相比，100 μg/mL POP處理組及VE陽性對照組處理后，JC-1在線粒體的基質中聚集形成聚合物，綠色熒光強度減弱，紅色熒光強度升高分別為41.78%±3.24%、51.48%±4.69%，線粒體膜電位升高。結果表明POP對D-gal誘導的A7r5衰老細胞線粒體膜電位具有保護作用。

圖6 POP對D-gal誘導的A7r5細胞線粒體膜電位的影響作用Fig.6 Effect of POP on the mitochondrial membrane potential of A7r5 cells induced by D-gal

3 討論

隨著老齡化社會的到來，衰老相關疾病阿爾茨海默病、2型糖尿病、骨質疏松、動脈粥樣硬化等可嚴重影響人群健康。因此，抗衰老的研究也成為衰老研究領域的熱點。本研究采用水提醇沉法提取傳統(tǒng)中草藥玉竹根中的多糖活性成分，在料液比為1:20 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時間為2.5 h條件下POP得率可達到8.23%，測得所提取的POP總糖含量為76.48%±0.036%。通過β-gal染色法、活性氧染色法、JC-1染色法深入探討POP體外抗衰老的生物學過程。

D-gal致衰老模型的生化指標和生理指標均與自然衰老相似，并廣泛用于抗衰老的研究[24]。目前有很多研究應用D-gal構建衰老模型，誘使ROS累積產(chǎn)生氧化應激[25-26]。Liu等[27]應用D-gal誘導心肌細胞衰老，影響心肌細胞內(nèi) SA-β-gal活性、ROS的產(chǎn)生及MDA含量。本研究成功構建D-gal誘導A7r5細胞衰老模型，并進一步證實POP可呈劑量依賴性增強A7r5細胞活性，且濃度在100 μg/mL時可顯著保護D-gal誘導的A7r5細胞存活率下降，維持細胞正?；钚?。蔣春茂等[28]的研究證實POP濃度為1250 μg/mL時可增強T淋巴細胞的活性，并增強脂多糖刺激后脾臟B淋巴細胞的活性。王迦琦等[29]研究表明植物中多糖成分具有提高細胞存活率，保護細胞氧化損傷的能力。

衰老細胞通常在pH6.0時有高酶活性的SA-βgal，目前SA-β-gal已被證實與衰老密切相關[30]。SA-β-gal作為一種溶酶體水解酶，是目前應用最廣泛的細胞衰老生物標志物[31]。吳爽等[32]的研究中表明衰老的人皮膚成纖維細胞中SA-β-gal活性顯著升高。本研究檢測不同組別A7r5細胞中SA-β-gal活性的變化，與模型組相比，POP可降低 D-gal誘導的A7r5細胞中SA-β-gal活性。因此POP可以減少衰老細胞中SA-β-gal的產(chǎn)生。

D-gal可誘導細胞代謝及特異性酶的改變，半乳糖合成酶可將D-gal氧化產(chǎn)生大量自由基，并使ROS水平增加，導致DNA穩(wěn)定性遭到破壞進而誘導氧化應激反應，損傷細胞，改變細胞膜的成分，從而誘導細胞衰老[33-34]。ROS在細胞生物學中發(fā)揮重要的作用，它們主要來源于線粒體[35-36]。ROS的產(chǎn)生可以引發(fā)氧化應激[37]，從而導致線粒體功能紊亂。細胞衰老與線粒體功能障礙有很大的聯(lián)系。許夢然等[38]證實植物中草藥中的多糖成分可有效抑制ROS水平，保護及線粒體膜電位穩(wěn)定。但目前還未有關于POP抑制氧化應激保護線粒體膜電位的研究。應用線粒體膜電位的變化反應其線粒體功能的穩(wěn)定性，在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光。在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體產(chǎn)生綠色熒光[39-40]。我們的研究證實，與模型組相比，POP可使D-gal誘導的A7r5細胞中ROS水平明顯降低，抑制氧化應激，此時JC-1多為聚合體形式紅色熒光增強，線粒體膜電位升高。因此POP可抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制線粒體膜電位下降使線粒體膜電位穩(wěn)定，從而保護D-gal誘導的A7r5細胞衰老。

4 結論

多糖為玉竹中最主要成分，毒副作用小，具有藥食同源的功效。本研究應用簡單、易操作、得率高的水提醇沉法提取POP。并將所提取純化的POP作用于A7r5細胞研究其對D-gal刺激A7r5細胞損傷的保護作用。細胞實驗表明POP可有效地促進細胞增殖，增強細胞活力，抑制D-gal誘導A7r5細胞存活率下降，減少D-gal誘導A7r5細胞衰老時SA-βgal的產(chǎn)生。POP可降低經(jīng)D-gal誘導后A7r5細胞中ROS的熒光強度，抑制氧化應激保護線粒體膜電位穩(wěn)定，從而抑制細胞衰老。在今后的研究中，本實驗將針對其生物學分子機制，更深入地研究POP的抗衰老作用機制，為POP的應用及抗衰老食品的研發(fā)領域提供理論依據(jù)。