高通量測序解析驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的潛在分子機(jī)制

廖 峰，樊雨梅，帖 航，趙海晴，蘇 寧,

（1.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252201；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

皮膚傷口愈合是一個復(fù)雜的過程，包括炎癥、增殖和重塑等一系列連續(xù)和重疊的病理生理過程。這一過程涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年全世界約有2000萬人受慢性傷口的困擾，且隨著人口老齡化的加重、肥胖和糖尿病等人群的不斷上升，遭受困擾的人群可能會繼續(xù)增加[2]。因此，尋找安全有效的促進(jìn)傷口愈合的功效成分成為了研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)代研究表明，使用膠原蛋白等天然成分可有效改善傷口愈合過程。膠原蛋白發(fā)揮趨化作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞黏附到傷口，并能有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[3]。膠原蛋白還能激活巨噬細(xì)胞[4]，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和生長因子的表達(dá)，促進(jìn)傷口愈合過程中的血管生成[5]。此外，膠原蛋白還能促進(jìn)傷口組織中膠原沉積和組織重塑[6]，進(jìn)一步促進(jìn)傷口愈合。據(jù)報(bào)道，牛骨膠原寡肽[7-8]、鹿茸膠原蛋白[9]、馬膠原蛋白[10]、魚皮膠原蛋白[11-13]、魚鱗膠原蛋白[14]和魚骨膠原蛋白[3]等均可有效促進(jìn)傷口愈合。

膠原蛋白主要來源于豬、牛的皮和骨，漁業(yè)來源的膠原蛋白正在逐年增加。但因豬、牛來源的膠原蛋白存在瘋牛病、口蹄疫及宗教原因的風(fēng)險(xiǎn)，漁業(yè)來源的膠原蛋白尤其冷水魚膠原蛋白穩(wěn)定差、流變性差[15]，限制了豬、牛以及漁業(yè)來源膠原蛋白的廣泛應(yīng)用。馬和驢幾乎沒有人畜共患病[16-17]和報(bào)道的免疫反應(yīng)[18]，使得馬和驢膠原蛋白的開發(fā)逐漸成為研究熱點(diǎn)。據(jù)Gallo等[19]報(bào)道，馬腱膠原材料具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止血、刺激血管生成和成纖維細(xì)胞遷移的能力。但是，關(guān)于驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的研究尚未報(bào)道。

因此，本研究擬通過驢骨膠原蛋白對成纖維細(xì)胞增殖、遷移以及I型膠原蛋白分泌量的影響，初步探究驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的作用，并采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)（RNA Sequencing，RNA-Seq）篩選驢骨膠原蛋白作用于成纖維細(xì)胞后的差異表達(dá)基因以及作用通路，揭示驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的可能作用機(jī)制，以期為今后驢骨膠原蛋白的開發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢骨 山東天龍?bào)H產(chǎn)業(yè)研究院；胎牛血清（FBS）、PBS、青霉素/鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司；CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BrdU試劑盒 Roche公司；人I型膠原蛋白ELISA試劑盒 Cusabio公司；人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDFs）ATCC細(xì)胞庫；人成纖維細(xì)胞（FB細(xì)胞） 博溪生物科技有限公司。

MULTISKAN GO多功能酶標(biāo)儀、371二氧化碳培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)、ABI 7500熒光定量PCR儀 Thermos公司；2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統(tǒng) Agilent公司；JY600E電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 驢骨膠原蛋白的制備 驢骨→解凍清洗→破粒→高溫蒸煮提?。?倍純凈水，140 ℃，攪拌3 h）→出液→酶解（1倍純凈水，60 ℃加風(fēng)味蛋白酶（酶活：1.52×104U/g）酶解 1 h→滅酶（140 ℃，1 h）→均質(zhì)→濃縮→噴霧干燥→驢骨膠原蛋白粉[20]。

1.2.2 驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合效果的初步探究

1.2.2.1 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞存活率的影響實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、溶劑對照組、實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓φ战M和實(shí)驗(yàn)組將處于對數(shù)生長期的NHDFs細(xì)胞以密度 8×104/mL 接種于 96孔板，每孔 100 μL，空白對照組加入100 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個平行復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組分別加入 100 μL含不同濃度驢骨膠原蛋白（0.16、0.31、0.63、1.25、2.50和 5 g/mL）的 DMEM完全培養(yǎng)基。溶劑對照組和空白對照組分別加入100 μL完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，用200 μL預(yù)溫的PBS清洗2次。去除清洗溶液，每孔準(zhǔn)確加入100 μL CCK8工作液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 h，在450 nm下測定吸光度。按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.2.2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)分為溶劑對照組、實(shí)驗(yàn)組，各組均需要同時設(shè)置對應(yīng)的背景組，背景組與對應(yīng)組的所有操作一致，只是不添加BrdU試劑，用以扣除BrdU的背景。實(shí)驗(yàn)組將處于對數(shù)生長期的 NHDFs細(xì)胞以密度8×103個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL，常規(guī)培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）24 h。實(shí)驗(yàn)組與其對應(yīng)的背景組換上 100 μL 含不同濃度驢骨膠原蛋白（0、0.02、0.05、0.09、0.19、0.38、0.75和 1.5 g/mL）的 DMEM完全培養(yǎng)基。溶劑對照組及其對應(yīng)的背景組分別加入100 μL完全培養(yǎng)基。加藥后在培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后按照BrdU試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.2.3 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞遷移的影響收集對數(shù)生長期NHDFs細(xì)胞，按照細(xì)胞密度為8×105個/孔接種至6孔板，每孔含培養(yǎng)液2 mL。在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng) 24 h后，使用無菌槍頭劃出劃痕，用PBS沖洗2次以去除劃痕區(qū)殘留細(xì)胞。劃痕后隨機(jī)分為陽性對照組、空白對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置3個平行。陽性對照組加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，空白對照組加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入驢骨膠原蛋白濃度為1.5 g/mL的不含胎牛血清的培養(yǎng)基。加藥后在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，于倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的愈合情況并照相記錄，使用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算劃痕區(qū)面積的平均值，按照下面公式計(jì)算劃痕區(qū)遷移率。

1.2.2.4 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞Col I蛋白表達(dá)的影響 將NHDFs細(xì)胞以5×105個/mL接種至24 孔板，在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng) 24 h 后，將生長接近融合的細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，即換用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓2 h。隨機(jī)分為陽性對照組、空白對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置3個平行。陽性對照組加入含15 μmol/L的抗壞血酸（VC）的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入驢骨膠原蛋白濃度為1.5 g/mL的培養(yǎng)基，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液備用。按照膠原蛋白ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NHDFs細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白含量。

1.2.3 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞功能的初步探究

1.2.3.1 RNA-Seq檢測差異表達(dá)的基因 將成纖維細(xì)胞以4×105個/mL接種至6孔板中， 37 ℃，5% CO2中孵育過夜。實(shí)驗(yàn)組加入含驢骨膠原蛋白的培養(yǎng)基，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。向細(xì)胞中加入1 mL Trizol，待融化成液體后轉(zhuǎn)入Ep管中，收樣備用。Trizol法提取模型總RNA，并進(jìn)行質(zhì)檢。RNA樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。隨后加入適量打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板合成cDNA。經(jīng)過磁珠純化、末端修復(fù)、加堿基A尾并連接測序接頭，然后進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫。用Agilent 2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統(tǒng)和ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測。文庫質(zhì)控合格后，用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測序，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3.2 差異表達(dá)基因的基因本體論及通路分析采用clusterProfiler軟件對差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。比較處理組與空白對照組的RNAseq有效數(shù)據(jù)，差異倍數(shù)≥1且P＜0.05視為差異表達(dá)基因。對于篩選的基因用基因本體論數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology）和注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（DAVID）進(jìn)行GO和KEGG分析。用P值反應(yīng)信號通路差異的顯著性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”（±SD）表示。多組數(shù)據(jù)差異比較采用方差分析，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*表示與空白對照組相比，P＜0.05；**表示與空白對照組相比，P＜0.01；#表示與陽性對照組相比，P＜0.05；##表示與陽性對照組相比，P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合效果的初步探究

2.1.1 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞存活率的影響用CCK-8檢測驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示（圖1），驢骨膠原蛋白在濃度為0.16～5 g/mL對NHDFs細(xì)胞無毒性作用，甚至顯示出一定的促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，細(xì)胞存活率可以提高18.14%～55.78%。

圖1 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of donkey bone collagen on the survival rate of NHDFs cells

2.1.2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞增殖的影響采用BrdU法研究驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見圖2。不同濃度的驢骨膠原蛋白作用NHDFs細(xì)胞24 h后，與空白對照組相比，在驢骨膠原蛋白濃度為0.75、1.50 g/mL時，驢骨膠原蛋白具有顯著的促進(jìn)NHDFs細(xì)胞增殖的作用（P＜0.05），細(xì)胞增殖率分別為131.25%、169.30%。因此，后續(xù)選擇濃度1.5 g/mL進(jìn)行下一階段實(shí)驗(yàn)。此外，驢骨膠原蛋白濃度在0.75～1.50 g/mL內(nèi)，能夠促進(jìn)NHDFs細(xì)胞增殖，且驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞增殖的影響呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

圖2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of donkey bone collagen on the proliferation of NHDFs cells

2.1.3 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞遷移的影響采用細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)，利用Image pro plus軟件計(jì)算，比較0和6 h劃痕面積的變化，探討不同濃度驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，2%胎牛血清作用后，NHDFs細(xì)胞遷移率增加6.26%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與劉磊等[21]報(bào)道的胎牛血清對成纖維細(xì)胞遷移率影響的效果一致，表明實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建成功。與空白對照組相比，1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白能顯著增加 NHDFs細(xì)胞遷移率（P＜0.05），且與2%胎牛血清促進(jìn)NHDFs細(xì)胞遷移的效果差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與狹鱈魚皮膠原蛋白肽作用后成纖維細(xì)胞遷移率的提高效果一致[22]?？梢?，驢骨膠原蛋白能夠顯著促進(jìn)NHDFs細(xì)胞的遷移融合，具有促進(jìn)傷口愈合效果。

圖3 各處理組對HaCaT細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effects of different treatments on the migration of HaCaT cells

2.1.4 驢骨膠原蛋白對膠原蛋白合成的影響 I型膠原蛋白（Collagen I，Col I）作為細(xì)胞組織間質(zhì)的重要組成成分，在傷口愈合過程中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報(bào)道，狹鱈魚皮膠原蛋白肽[22]、羅非魚皮Ⅰ型酶溶性膠原蛋白[23]均能促進(jìn)Col I的表達(dá)，有效控制傷口愈合過程。采用ELISA法檢測驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白的影響，結(jié)果見圖4。因抗壞血酸在促進(jìn)創(chuàng)面愈合和調(diào)節(jié)膠原蛋白生成中起重要作用[24]，選擇抗壞血酸作為陽性對照。結(jié)果顯示，濃度為15 μmol/L的抗壞血酸（VC）能夠明顯促進(jìn)Col I的表達(dá)（P＜0.01）。與空白對照組相比，1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白也能極顯著促進(jìn)Col I的表達(dá)（P＜0.01），但效果弱于15 μmol/L的抗壞血酸，Col I含量相差18.99 ng/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白能夠促進(jìn)Col I含量增加，但效果弱于15 μmol/L的抗壞血酸。

圖4 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞Col I含量的影響Fig.4 Effect of donkey bone collagen on the content of Col I in NHDFs

2.2 驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞功能的初步探究

2.2.1 驢骨膠原蛋白作用NHDFs細(xì)胞后主要差異表達(dá)基因 差異基因統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與空白對照組相比，驢骨膠原蛋白作用NHDFs細(xì)胞后，差異表達(dá)基因火山圖見圖5，其中每一個點(diǎn)代表一個基因，藍(lán)色點(diǎn)表示表達(dá)下調(diào)的基因，紅色點(diǎn)表示表達(dá)上調(diào)的基因。基于P＜0.05 且|-Log2（Fold change）|＞1 篩選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得差異表達(dá)基因384個，其中上調(diào)基因172個，下調(diào)基因212個。

圖5 差異表達(dá)基因火山圖Fig.5 Volcanic map of differentially expressed genes

2.2.2 差異表達(dá)基因GO富集分析 為初步明確驢骨膠原蛋白在成纖維細(xì)胞中發(fā)揮的具體生物學(xué)功能，分別對已鑒定出的384個差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO富集分析。通過GO富集分析可將差異表達(dá)的基因按功能分為：生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三類。GO功能富集結(jié)果顯示（見圖6），與空白對照組相比，驢骨膠原蛋白作用成纖維細(xì)胞后，差異表達(dá)基因參與的生物過程主要有中性粒細(xì)胞趨化性（neutrophil chemotaxis）、中性粒細(xì)胞遷移（neutrophil migration）、粒細(xì)胞趨化性（granulocyte chemotaxis），富集的分子功能主要包括細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、趨化因子活性（chemokine activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、趨化因子受體結(jié)合（chemokine receptor binding）、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合（G protein-coupled receptor binding）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding），差異基因在細(xì)胞組分條目下的富集分析沒有意義（經(jīng)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正方法校正后的P值＞0.05）。從GO富集結(jié)果推測，驢骨膠原蛋白參與成纖維細(xì)胞的免疫反應(yīng)的調(diào)控。研究表明，與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，慢性病人傷口成纖維細(xì)胞的五種趨化因子CXCL（CXC chemokine ligand，CXC 趨化因子配體；CXCL-1、-2、-3、-5 和-6）基因表達(dá)降低兩倍[25]。驢骨膠原蛋白作用于成纖維細(xì)胞的GO富集結(jié)果顯示，CXCL-3、CXCL-5、CXCL-6三種趨化因子上調(diào)，據(jù)此推測驢骨膠原蛋白可能通過調(diào)控CXCL趨化因子發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的作用。

圖6 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析Fig.6 GO annotation of the differentially expressed genes

2.2.3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析 為進(jìn)一步研究驢骨膠原蛋白作用成纖維細(xì)胞后差異表達(dá)基因參與的代謝通路，對所有差異基因進(jìn)行了KEGG富集分析。圖7為驢骨膠原蛋白作用于成纖維細(xì)胞涉及的信號通路的氣泡圖。結(jié)果顯示，差異基因參與的信號通路包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、化學(xué)致癌（Chemical carcinogenesis）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）和 TNF 信號通路（TNF signaling pathway）。

圖7 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析Fig.7 Enrichment analysis of KEGG pathway of the differentially expressed genes

在皮膚損傷中，IL-17的主要來源于巨噬細(xì)胞，在傷口愈合的早期炎癥階段發(fā)揮作用[26]。有研究表明，IL-17A能夠誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，包括CCL2（CC 趨化因子配體 2）、CXCL8、IL-Iβ和 IL-6[27-28]，這些細(xì)胞因子都與傷口愈合有關(guān)。缺乏IL-17可增強(qiáng)和加速皮膚組織的修復(fù)[29]。TNF蛋白超家族的典型成員TNF-α在炎癥和隨后的傷口愈合中起著關(guān)鍵作用[30]，TNF-α信號傳導(dǎo)介導(dǎo)炎癥分子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和死亡，并影響上皮傷口愈合。此外，TNF-α信號傳導(dǎo)還可介導(dǎo)上皮遷移，增強(qiáng)上皮細(xì)胞的存活和增殖，從而促進(jìn)傷口愈合[31]。Wang等[32]報(bào)道，在傷口愈合過程中，炎性巨噬細(xì)胞（Ly6C+）分泌的細(xì)胞因子能夠激活TNF和IL-17信號通路，TGF-β、HIF-1、NF-κB 和 Rap1信號通路與中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子高度相關(guān)。因此，驢骨膠原蛋白促進(jìn)成纖維細(xì)胞傷口愈合的機(jī)制與驢骨膠原蛋白刺激炎性巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子密切相關(guān)。KEGG通路富集結(jié)果顯示，IL-17和TNF信號通路中的IL-1β、IL-32、CXCL3、CXCL5、CXCL6等基因在驢骨膠原蛋白作用于成纖維細(xì)胞中表達(dá)有顯著差異，說明這些因子可能參與了驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的過程，為進(jìn)一步研究驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究通過研究驢骨膠原蛋白對成纖維細(xì)胞增殖、遷移以及Col I分泌量的影響，初步探究驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的效果。研究發(fā)現(xiàn)，驢骨膠原蛋白對NHDFs細(xì)胞沒有毒性，且在濃度0.16～5.0 g/mL時使NHDFs細(xì)胞存活率提高18.14%～55.78%。驢骨膠原蛋白濃度在0.75～1.50 g/mL內(nèi)對NHDFs細(xì)胞增殖的影響呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。另外，1.50 g/mL的驢骨膠原蛋白能明顯增加NHDFs細(xì)胞遷移率和促進(jìn)Col I的表達(dá)。

采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選驢骨膠原蛋白作用于成纖維細(xì)胞后的差異表達(dá)基因，以揭示驢骨膠原蛋白對成纖維細(xì)胞可能的作用途徑，為進(jìn)一步研究驢骨膠蛋白促進(jìn)皮膚傷口愈合的具體分子機(jī)制提供思路。結(jié)果表明，驢骨膠原蛋白作用NHDFs細(xì)胞后，共獲得差異表達(dá)基因384個。GO功能富集結(jié)果顯示，驢骨膠原蛋白參與的生物學(xué)過程主要有中性粒細(xì)胞趨化性、中性粒細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞趨化性，參與的分子功能主要包括細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結(jié)合等。KEGG富集分析表明，驢骨膠原蛋白參與成纖維細(xì)胞的信號通路包括IL-17信號通路和TNF信號通路。推測，驢骨膠原蛋白可能通過IL-17和TNF-α介導(dǎo)CXCL趨化因子發(fā)揮促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用，后需進(jìn)一步分子實(shí)驗(yàn)來探究驢骨膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的具體分子機(jī)制。