QuEChERS-SPE-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定調(diào)味面制品中的12種真菌毒素

徐子婷，郝莉花，馬 靜，衛(wèi)潤鑫，李曉明，范雯婷，路書彥

（河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，河南鄭州 450000）

辣條是一種以小麥粉和/或其他谷物粉等為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)配料、熟制、擠壓成型、調(diào)味、包裝等步驟制作而成的調(diào)味面制品[1]。調(diào)味面制品以獨特的口感，在國內(nèi)從兒童到老人不乏受眾，就連國外也有很多愛好者，可謂是“史上最牛零食”[2]。資料顯示，2009年調(diào)味面制品行業(yè)的年生產(chǎn)總值為100多億元，市場銷售額為170多億元[3]，到2016年，調(diào)味面制品行業(yè)年生產(chǎn)總值已增至330億元，市場銷售額增至510億元。8年間，該行業(yè)的生產(chǎn)總值增長230%，銷售額增長200%[4]。而到2018年底，2019年初調(diào)味面制品行業(yè)年產(chǎn)值規(guī)模已高達580多億元，并且這兩年調(diào)味面制品生產(chǎn)總值、銷售額仍在持續(xù)增長，已然成為全國方便休閑食品產(chǎn)業(yè)的新經(jīng)濟增長點。

調(diào)味面制品的主要原料為糧谷粉類，糧谷在生長、貯藏及運輸過程中都易滋生真菌毒素[5]，且使用受到真菌毒素侵染的糧谷粉加工制成的調(diào)味面制品，在市場上很難被消費者所發(fā)現(xiàn)。污染糧谷類及糧谷類制品的真菌毒素主要有玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、赭曲霉毒素 A（OTA）和 15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-AcDON）等。同時在調(diào)味面制品的生產(chǎn)過程中，需要使用食用油，而植物油和油料種子在生產(chǎn)和儲存期間極易產(chǎn)生多種真菌或受到多種真菌毒素的污染。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、伏馬毒素（FB）類、黃曲霉（AFT）類、玉米赤霉烯酮（ZEN）等真菌毒素都極易造成食用油及其制品的污染[6-7]。目前發(fā)現(xiàn)這些易引起糧谷、植物油污染的真菌毒素會對人體健康產(chǎn)生嚴重威脅，過量攝入受污染的食品會導致肝腎的功能性損壞、致癌、致畸，或誘發(fā)免疫抑制性疾病[8-9]。

根據(jù)相關文獻報道，真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）[10]、酶聯(lián)免疫吸附法[11]、氣相色譜法（GC）[12]、液相色譜法（HPLC）[13-14]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[15-16]；其中酶聯(lián)免疫法定性不穩(wěn)定，易出現(xiàn)假陽性，僅適用于快速檢測；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法樣品檢測前常需要衍生化處理，在一定程度上受到限制[17]；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法擁有液相色譜高效的分離技術以及質(zhì)譜高分辨率的檢測能力，具有準確性好、靈敏度高、特異性和選擇性強的特點，可多種組分同時檢測，是現(xiàn)開發(fā)在復雜基體樣品中同時測定多種真菌毒素的良好方法。目前我國現(xiàn)行的真菌毒素國標檢測方法主要針對單一類或少數(shù)幾種真菌毒素的檢測，且前處理方法互相獨立，檢測效率低下。而高通量真菌毒素檢測方法研究基質(zhì)多為糧谷與飼料，此外關于植物油、茶葉、方便面、香辛料中真菌毒素的檢測也有相應研究[18-21]，但是基質(zhì)相對復雜的調(diào)味面制品中多真菌毒素的高通量檢測方法目前還沒有相關的報道。

同時，高通量檢測方法的廣泛應用，還需要有效的樣品前處理方法為基礎，以保證最后的分析結(jié)果[22]。目前真菌毒素檢測常用的提取方法有加速溶劑萃取法、固相萃取法、免疫親和柱法及超臨界萃取法，這些提取方法常用于單一類真菌毒素的提取。而QuEChERS技術具有待測物回收率高、應用范圍廣、分析速度快、污染小和操作簡單等優(yōu)勢，已廣泛用于動植物源性食品中獸藥、農(nóng)藥殘留等的測定中。將QuEChERS和固相萃?。⊿PE）聯(lián)合使用，能很好的減弱樣品的基質(zhì)效應。為此，本研究采用QuEChERS與SPE技術結(jié)合作為前處理方法，并對該方法進行改進和優(yōu)化，在此基礎上，建立了采用UPLC-MS/MS法同時測定調(diào)味面制品中12種真菌毒素的高通量檢測和確定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

40份調(diào)味面制品 20份購自鄭州市各大超市、小食雜店，20份購自京東、淘寶、拼多多等網(wǎng)站；12種真菌毒素標準品：黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素 B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素 G1（Aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素 G2（Aflatoxin G2，AFG2）、玉米赤酶烯酮（Zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynival fusenol，DON）、3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-Acetyldeoxynival fusenol，3-AcDON）、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-Acetyl-deoxynival fusenol，15-AcDON）、T-2 毒素（T-2 toxin，T-2）、赭曲霉毒素 A（Ochratoxin A，OTA）、伏馬毒素 B1（Fumatoxin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素 B2（Fumatoxin B2，F(xiàn)B2） 均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

PRiME HLB 固相萃取柱（3 cc，150 mg）、HLB固相萃取柱（6 cc，50 mg）、I-Class-TQS 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；PSA、C18、中性氧化鋁凈化填料 月旭科技（上海）股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂 分析純，天津市恒興試劑有限公司；甲酸、乙酸銨 MS級，德國賽默飛世爾公司；乙腈 MS級，美國霍尼韋爾公司；VeloCity 14R Pro離心機 英國達美柯公司；MS-TS分析天平美國梅特勒-托利多公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；HD-2500多管渦旋混合器 杭州佑寧儀器有限公司；5982-911012孔真空固相萃取儀美國安捷倫公司；N-Evap氮吹儀 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 提?。涸?0 mL離心管中稱取2 g經(jīng)粉碎機粉碎的均勻試樣，加入20 mL 甲酸-乙腈-水（5:45:50，v/v），渦旋振蕩 10 min，加入 4 g MgSO4，1.5 g NaCl，用手大力振搖 1 min。離心（4000 r/min，5 min）后，取部分上清液待凈化。

凈化：取萃取柱 PRIME HLB（3 cc，150 mg）放在12孔固相萃取儀上，無需活化，取0.5 mL上清液預過柱，棄去濾液。裝入收集管，移取2 mL上清液過萃取柱并收集濾液，定量取1 mL濾液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管（提前裝有 150 mg MgSO4，50 mg PSA，30 mg C18，30 mg Al-N）中，渦旋 1 min，離心（13000 r/min，3 min）后取 500 μL 上清液，氮吹后復溶于 500 μL 乙腈-水（90:10，v/v）中，經(jīng) 0.22 μm 膜過濾后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.2.2 基質(zhì)匹配標準溶液的制備 分別移取適量12種真菌毒素單標準溶液，用乙腈稀釋并定容，配制成混合標準溶液，于-18 ℃儲存。稱取空白調(diào)味面制品樣品，按1.2.1方法操作，得到空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋混合標準溶液配置成一系列混合基質(zhì)匹配標準溶液，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 色譜條件 UPLC色譜柱：CORTECS C18+（2.1×100 mm，粒徑 1.6 μm）；色譜柱溫：40 ℃；流動相A相：0.1%（v/v）甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸銨），B 相：0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；進樣體積：6 μL，UPLC色譜梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 HPLC gradient elution conditions

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離源：采用電噴霧電離源（ESI）正模式掃描；調(diào)整離子源溫度：500 ℃；毛細管電壓：1.50 kV；MS采用多反應監(jiān)測方式（MRM）；12種化合物的質(zhì)譜采集參照表2。

表2 12種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Tandem mass spectrometry parameters of 12 mycotoxins

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

本研究對測定真菌毒素的流動相進行考察，發(fā)現(xiàn)真菌毒素類化合物易溶于甲醇或乙腈，其中幾種毒素類化合物中含有-OCOCH3乙酰氧基團，而乙酰氧類化合物在甲醇溶劑中不穩(wěn)定，因此當流動相選用乙腈:水體系時，該類化合物在色譜柱上的洗脫效果和正模式下的響應強度均好于甲醇:水體系。在乙腈:水體系中嘗試加入適量甲酸，發(fā)現(xiàn)靈敏度得到顯著提高，這應該是增加了毒素類化合物在電噴霧電離時的離子化效率。當流動相選擇為0.1%（v/v）甲酸水：0.1%（v/v）甲酸乙腈以初始比例90:10進行梯度洗脫時，觀察到AFG2峰形拖尾嚴重，加入少量乙酸銨后，這種拖尾峰的情況得到有效改善。所以本研究最終選擇含5 mmol/L乙酸銨的0.1%（v/v）甲酸水溶液和0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液作為流動相，其質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 12種真菌毒素質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrogram of 12 mycotoxins

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取溶劑的優(yōu)化 本研究探究了不同提取溶劑對真菌毒素提取效果的影響，采用50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液和添加5%甲酸的50%乙腈水溶液對調(diào)味面制品中的12種真菌毒素進行提取，提取后加入 4 g MgSO4，1.5 g NaCl，用手大力振搖 1 min。離心（4000 r/min，5 min）后，取上層有機相過0.22 μm膜，上機進行測定。不同提取溶劑對真菌毒素的回收率影響見圖2。

由圖2可知，12種真菌毒素中，AFB2、3-ADON、OTA、FB1、FB2這5種真菌毒素在50%甲醇水溶液的回收率和50%乙腈水溶液的回收率差異性并不顯著（P＞0.05），剩余7種真菌毒素的回收率有顯著性差異。這是由于甲醇、乙腈作為2種通用型提取溶劑，乙腈較甲醇具有更好的選擇性，可以避免提取更多脂肪、色素等雜質(zhì)，且乙腈的提取效率更好，因此本研究采用乙腈作為提取溶劑[23]。

從圖2中還可看出，添加5%甲酸50%乙腈水溶液，12種真菌毒素回收率均為最高。分析其原因，因為本研究待測真菌毒素中伏馬毒素、赭曲霉毒素具有羧基集團，親水性較強，使用高有機相體系會導致其回收率部分損失，故需要使用水含量較高的提取溶劑進行提取。但提取液中的高比例的水會大量溶出基質(zhì)中的雜質(zhì)，造成方法靈敏度降低，從而部分毒素的回收率也會顯著下降[24]。同時，像DON、ZEN、OTA、FB1、FB2對酸敏感，降低萃取液的pH能提高穩(wěn)定性，增加萃取效率，因此為保證各種真菌毒素的提取效果，還需在提取液中添加輔助試劑（乙酸、甲酸等），以增強聯(lián)合提取的效果[11]，而甲酸、乙酸效果相近，本研究選用甲酸。

圖2 不同提取溶劑對回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on recovery rate

2.2.2 固相萃取柱的優(yōu)化 由于調(diào)味面制品中有大量親脂性雜質(zhì)、中性鹽的存在，會降低色譜柱的壽命，同時增大基質(zhì)效應，干擾目標化合物的分析；若選擇專一性較強的萃取小柱，雖然對測定某種或某類化合物的效果較好，但對多組分中性質(zhì)差異較大的樣品，會對某些組分的吸附性較差而影響回收率[25]。

HLB為反相固相萃取柱，對目標物進行吸附，樣品中的雜質(zhì)將在淋洗步驟中除去，反相萃取柱的上樣液一般為大比例的水相，本研究需要把乙腈蒸發(fā)并置換成水相，才能使目標物在柱子上保留，增加了前處理時間；而Prime-HLB柱選擇吸附雜質(zhì)，對目標物沒有吸附，作為聚合物柱不需要活化，可直接萃取，簡化了過柱子流程[26]；通過考察3種加標水平下多種真菌毒素的回收率發(fā)現(xiàn)，Prime-HLB柱均優(yōu)于HLB柱，特別是ZEN經(jīng)HLB凈化后回收率穩(wěn)定性較差，無法準確定量。造成回收率損失的原因是在HLB這類柱子的操作中，目標物的吸附和選擇淋洗液進行雜質(zhì)淋洗都容易丟失化合物，且ZEN在酸性溶劑凈化中才能獲得較高的回收率[27]，詳見圖3～圖5。

圖3 低濃度水平（0.6～20 μg/kg）加標回收率Fig.3 Recovery rate at low concentration level (0.6～20 μg/kg)

圖4 中濃度水平（1.5～50 μg/kg）加標回收率Fig.4 Recovery rate at medium concentration level(1.5～50 μg/kg)

圖5 高濃度水平（3.0～100 μg/kg）加標回收率Fig.5 Recovery rate at high concentration level(3.0～100 μg/kg)

2.2.3 凈化條件的優(yōu)化 調(diào)味面制品中存在大量干擾物如色素、脂質(zhì)等，因此凈化步驟對定性、定量結(jié)果，尤其是定量的準確性非常重要。QuEChERS法常用凈化填料有：石墨化碳黑（GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、中性氧化鋁（Al-N）和乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）等。據(jù)文獻報道，GCB對具有平面分子結(jié)構(gòu)的化合物有顯著的吸附效果[28]，可以脫除某些色素，同時它也能脫除具有平面結(jié)構(gòu)的毒素，如AFT和ZEN等[29]；C18作為非極性吸附劑能夠吸附基質(zhì)中非極性物質(zhì)，在去除樣品中的脂質(zhì)、糖類等有機化合物起到有效作用，但也會使得脂溶性物質(zhì)的檢測結(jié)果變差，且單獨使用凈化能力有限；PSA是一種堿性吸附劑，在結(jié)構(gòu)上有兩個氨基，可以通過氫鍵結(jié)合去除碳水化合物、有機酸和少量色素，但它也會導致酸性化合物的檢測結(jié)果減低[22]；中性氧化鋁Al-N可以吸附芳香烴和脂肪胺等富電化合物。因此本研究在選取QuEChERS凈化試劑時，分別選取了A組：50 mg PSA，30 mg C18，30 mg Al-N，150 mg MgSO4；B 組：50 mg PSA，150 mg MgSO4；C 組：30 mg C18，150 mg MgSO4；D 組：30 mg Al-N，150 mg MgSO4。通過比較經(jīng)PSA、C18和Al-N分別與MgSO4組合凈化后的樣品提取液凈化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于12種真菌毒素，B組和 D組回收率較差。A組和 C組對 AFB1、AFB2、DON、3-ADON和FB2這5種毒素回收率差異性并不顯著（P＞0.05），對 AFG1、AFG2、ZEN、15-ADON、T-2、OTA和FB1這7種毒素回收率差異性明顯，且A組回收率普遍高于C組，表明A組不僅能起到良好的凈化作用，還能得到較高的回收率，最終確定50 mg PSA、30 mg C18、30 mg Al-N、150 mg MgSO4混合填料作為QuEChERS凈化吸附劑，詳見圖6。

圖6 不同凈化劑對回收率的影響Fig.6 Effects of diffent purifiers on recovery rate

2.3 方法驗證

2.3.1 標準曲線與檢出限 根據(jù)12種化合物的響應強弱顯示，在空白調(diào)味面制品基質(zhì)溶液中添加系列濃度的真菌毒素，配制標準溶液。用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，縱坐標選為峰面積（Y），橫坐標為對應的質(zhì)量濃度（X，ng/mL），繪制標準曲線，參見表3。

由表3可知，這12種化合物在0.3～1000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能夠呈現(xiàn)良好的線性關系，其決定系數(shù)（R2）均不低于0.99。根據(jù)添加回收試驗，以3倍信噪比（S/N）確定該12種真菌毒素的檢出限（LOD）為 0.10～3.0 μg/kg，以 10 倍信噪比（S/N）確定該12 種真菌毒素的定量限（LOQ）為 0.30～10.0 μg/kg。2.3.2 回收率與精密度 取空白調(diào)味面制品樣品，以低、中、高（2倍定量限、5倍定量限、10倍定量限）三種濃度，每個加標水平選取6個平行樣，添加12種真菌毒素標準品后按照1.2.1進行試驗，12種真菌毒素的平均回收率為84.2%～97.2%，相對標準偏差為3.25%～8.77%，符合GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[30]標準中關于定性定量要求，同時也符合痕量分析標準含量低于百萬分之一的要求?；厥章逝c精密度數(shù)據(jù)見表4。

表3 12種真菌毒素的線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, determination coefficients (R2), LODs and LOQs of 12 mycotoxins

表4 空白樣品中12種真菌毒素的加標回收率與相對標準偏差Table 4 Recoveries and RSDs for 12 mycotoxins

2.4 實際樣品的檢測

采用建立的QuEChERS-SPE-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對40份調(diào)味面制品進行分析，其中3份樣品檢出黃曲霉毒素B1，含量分別為0.32、0.62、0.66 μg/kg；2份樣品檢出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，含量分別為2.4、3.1 μg/kg?，F(xiàn)行的國家標準GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[31]并未對調(diào)味面制品中的黃曲霉毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇做出限量規(guī)定，可以參考GB 2761-2017植物油脂（花生油、玉米油除外）中黃曲霉毒素B1限量10 μg/kg、花生油、玉米油黃曲霉毒素B1限量20 μg/kg；谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量1000 μg/kg。根據(jù)以上標準，本研究所取的40份樣品中，雖然部分樣品黃曲霉毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢出結(jié)果呈陽性，但其含量均低于真菌毒素限量標準。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合QuEChERS-固相萃取SPE前處理方法的優(yōu)點，建立了UPLC超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測調(diào)味面制品中12種真菌毒素的檢測方法。在對實際樣品進行測定時，電噴霧電離源ESI+模式下，MRM多反應監(jiān)測掃描，6 min內(nèi)12種化合物均能出峰，同時本方法還具有較低的檢出限和定量限。因此本方法具有快速、準確、回收率高，靈敏度高等特點，適用于調(diào)味面制品中12種真菌毒素殘留的定性分析和定量分析，補充了調(diào)味面制品中多種真菌毒素的定量確證檢測方法。