響應(yīng)面法優(yōu)化三葉青總黃酮提取工藝及不同產(chǎn)地三葉青的質(zhì)量評(píng)價(jià)

徐志杰，黃子洳，馬方芳，張善華，程汝濱，黃 真，鐘曉明,

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053；2.遂昌縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江麗水 323300）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）學(xué)名三葉崖爬藤，為葡萄科崖爬藤屬植物，又名蛇附子、石抱子、金線吊葫蘆，是我國(guó)特有瀕危珍稀藥用植物，主產(chǎn)于我國(guó)浙江、江西、福建和廣西等地[1]。三葉青以塊根入藥為主，味微苦、性平，具有清熱解毒、消腫止痛、化痰散結(jié)等功效[2]。三葉青除藥用外，也常作為藥膳食材，目前市面已有三葉青茶類產(chǎn)品，開水沖泡即可飲用，是西藥無(wú)法替代的“植物抗生素”[3]。

三葉青的品種因地區(qū)不同而存在一定的區(qū)別，福建、湖南、云南、廣東、廣西等地的三葉青為青藤三葉青，浙江、江西一帶的三葉青則為紫藤三葉青[4-5]。青藤三葉青分布地域較廣，適應(yīng)能力強(qiáng)，產(chǎn)量較高；而紫藤三葉青產(chǎn)量不高，且生長(zhǎng)年限長(zhǎng)，但其藥用功效更佳[6]。由于受地理因素及氣候環(huán)境等影響，不同產(chǎn)地的三葉青化學(xué)成分的含量和組成表現(xiàn)出明顯的差異性。不同產(chǎn)地的三葉青質(zhì)量參差不齊，缺乏科學(xué)有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，不利于三葉青產(chǎn)業(yè)的規(guī)模擴(kuò)大和后續(xù)健康產(chǎn)品的開發(fā)。

黃酮類成分作為三葉青的主要藥效成分和質(zhì)控指標(biāo)[7-8]，在抗癌[9]、抗氧化[10]、提升免疫力[11]、抗病毒[12]、神經(jīng)保護(hù)[13]和抗炎[14]等方面均顯示出廣泛的生理活性。然而三葉青總黃酮提取工藝落后，提取得率較低[15]，不利于三葉青黃酮的大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用。同時(shí)，雖然目前已有不少關(guān)于三葉青指紋圖譜的研究，如李士敏等[16]、張曉芹等[17]、金曉懷[18]均對(duì)三葉青HPLC指紋圖譜有一定的研究，但所采集的三葉青樣品產(chǎn)地較為局限，難以反映和區(qū)分全國(guó)各產(chǎn)地三葉青的整體質(zhì)量。故本研究收集了全國(guó)9個(gè)不同產(chǎn)地的18批三葉青樣品，采用Box-Behnken法優(yōu)化三葉青中總黃酮的提取工藝，測(cè)定不同產(chǎn)地三葉青的總黃酮得率，并建立不同產(chǎn)地三葉青HPLC指紋圖譜，結(jié)合相似度分析、聚類分析和主成分分析來評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地三葉青的質(zhì)量，以期為規(guī)范三葉青銷售市場(chǎng)以及三葉青資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三葉青干燥塊根 樣品來源信息詳見表1，各產(chǎn)地均采集2批樣品，共9個(gè)產(chǎn)地18批三葉青樣品，其中廣西南寧、云南楚雄產(chǎn)三葉青為原產(chǎn)地采集，其他產(chǎn)地三葉青樣品分別購(gòu)于全國(guó)各地的藥材市場(chǎng)，三葉青樣品經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉青Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg的干燥塊根；蘆丁、槲皮素、山柰酚 批號(hào)分別為T27F10Z81699、C01J10Y91727、G11A11L110978，純度均＞98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈 色譜純，美國(guó)Tedia公司；乙醇、磷酸、甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；超純水 Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

表1 各產(chǎn)地三葉青信息Table 1 Information of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

DZF數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海榮亞生化儀器廠；恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器廠；紫外分光光度計(jì)日本島津公司；Waters高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三葉青總黃酮的提取工藝優(yōu)化

1.2.1.1 三葉青總黃酮的提取 選取道地產(chǎn)地浙江臺(tái)州的三葉青為供試品，將其粉碎后過50目篩，真空干燥至恒重，得到樣品粉末。精密稱取粉末1.0 g，在一定提取時(shí)間、提取溫度、液料比、乙醇濃度下于恒溫水浴鍋中進(jìn)行冷凝回流提取，將濾液抽濾，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中定容，備用。

1.2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)[15,19]并加以修改，精密稱取蘆丁對(duì)照品10.0 mg，用60%乙醇定容至 10 mL，搖勻，即得1 mg·mL-1對(duì)照品溶液。精密吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的蘆丁1.0 mg·mL-1對(duì)照品儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min。再加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min。最后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，加水定容至25 mL，搖勻，靜置15 min。以加純水的試劑作為空白，測(cè)定樣品在510 nm處的吸光度A，以蘆丁質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到回歸方程：A=0.4705X-0.0035（R2=0.9999）。

1.2.1.3 三葉青總黃酮的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取三葉青樣品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按照“1.2.1.2”中所述方法進(jìn)行操作并計(jì)算三葉青總黃酮得率[20]，計(jì)算公式如下：

式中，Y 為三葉青總黃酮得率（mg·g-1）；C 為總黃酮的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V為測(cè)量總黃酮提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為稱量的三葉青樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.1.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以三葉青總黃酮得率為指標(biāo)，固定提取時(shí)間90 min、提取溫度 70 ℃、料液比1:30 g·mL-1、乙醇濃度70%時(shí)，分別考察不同提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g·mL-1）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)三葉青總黃酮得率的影響，各實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。

1.2.1.5 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、乙醇濃度（D）作為影響因素，總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)（Y），應(yīng)用 Box-Behnken 中心組合進(jìn)行4因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels used in response surface analysis

1.2.2 三葉青指紋圖譜的建立

1.2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 取蘆丁、槲皮素、山柰酚對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含蘆丁10.1 μg、槲皮素9.7 μg、山柰酚8.8 μg的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取各產(chǎn)地三葉青粉末1.0 g，以最佳提取工藝進(jìn)行提取，抽濾1次，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，定容至刻度。后置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)蛹状汲曋寥芙猓D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容至刻度，用0.22 μm微孔濾膜濾過，得到供試品溶液，備用。

1.2.2.3 色譜條件 色譜柱為Waters Sunfire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為 0.2% 磷酸水-乙腈，梯度洗脫（0～30 min，15%～20% 乙腈；30～35 min，20%～33% 乙腈；35～50 min，33% 乙腈；50～60 min，33%～60%乙腈）；流速為 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫為 40 ℃；進(jìn)樣量為 10 μL。

1.2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取S1樣品，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次[21]，以槲皮素峰為參考峰，計(jì)算得出各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

1.2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1樣品，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.2.3”項(xiàng)條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定[21]，計(jì)算得出各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

1.2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6份S1樣品，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，在“1.2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定[21]，計(jì)算得出各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

1.2.4 指紋圖譜分析

1.2.4.1 相似度評(píng)價(jià) 將18批各產(chǎn)地三葉青液相色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，以S1樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)置為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和自動(dòng)峰匹配，生成指紋疊加圖譜，確定共有峰。以對(duì)照?qǐng)D譜為參照，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

1.2.4.2 聚類分析 采用SPSS20.0軟件以18批三葉青樣品的共有峰面積為變量，采用組間連接聚類方法，以平方Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

1.2.4.3 主成分分析 采用SPSS20.0軟件對(duì)18批三葉青樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，采用降維、因子分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣，主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率及主成分綜合得分等。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青總黃酮的提取工藝優(yōu)化研究

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 提取時(shí)間、溫度、料液比、乙醇濃度各單因素對(duì)三葉青總黃酮得率影響如圖1所示。由圖1A可知，三葉青總黃酮得率隨著時(shí)間的增加先升后下降，并在提取時(shí)間60 min時(shí)得率達(dá)到最大值。提取時(shí)間較短時(shí)，黃酮類成分尚未完全溶出，而提取時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，可能會(huì)使三葉青黃酮中熱不穩(wěn)定成分在長(zhǎng)時(shí)間提取中遭到破壞降解，使得總黃酮得率下降[22]。由圖1B可知，總黃酮得率隨著溫度的升高先上升再下降，在80 ℃時(shí)得率達(dá)到最大值。當(dāng)溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，黃酮類物質(zhì)溶出增加，故總黃酮得率上升。而當(dāng)溫度過高時(shí)，可能導(dǎo)致黃酮類化合物氧化變性，使得總黃酮得率下降[23]。由圖1C可知，當(dāng)料液比從 1:10 g·mL-1增加到 1:30 g·mL-1的過程中，總黃酮得率增加，并在料液比1:30 g·mL-1時(shí)得率達(dá)到最大值；但當(dāng)繼續(xù)提高料液比時(shí)，得率下降，可能是高料液比時(shí)溶出的黃酮類物質(zhì)被稀釋，伴隨著非黃酮類雜質(zhì)增多，使得黃酮得率下降[24]。由圖1D可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值。當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí)，總黃酮得率下降，推測(cè)當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，溶劑的極性相對(duì)降低，導(dǎo)致其他非黃酮類物質(zhì)溶出，使得總黃酮得率下降[25]。綜合上述因素，確定響應(yīng)面分析的各因素考察水平分別為時(shí)間30、60、90 min，溫度70、80、90 ℃，料液比1:20、1:30、1:40 g·mL-1，乙醇濃度 50%、60%、70%。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的三葉青總黃酮的最佳提取條件為時(shí)間 60 min，料液比 1:30 g·mL-1，乙醇濃度 60%，溫度80 ℃，該條件下總黃酮得率為37.27 mg·g-1。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor test results

2.1.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、乙醇濃度（D）為自變量，以總黃酮得率為響應(yīng)值，采用 Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)4因素 3水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)，如表3所示。得到總黃酮得率關(guān)于以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、乙醇濃度（D）的回歸方程：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests

Y=37.73+0.30A+1.86B+0.079C-0.44D+1.18AB-0.80AC+0.43AD-0.059BC+104BD+0.24CD-1.96A2-3.83B2-3.41C2-4.70D2。

由表4 ANOVA方差分析可知，實(shí)驗(yàn)所選模型的決定系數(shù)R2=0.9836，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.9672，模型F=60.00，P＜0.0001，表明該模型具有極顯著性意義；失擬項(xiàng)P＞0.05，沒有顯著差異，表明該模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度良好。B、D、AB、AC、BD、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，表明其對(duì)總黃酮得率具有顯著性影響。變異系數(shù)CV值為1.84%，說明模型的重現(xiàn)性很好，該模型可用于三葉青總黃酮的提取工藝優(yōu)化。各因素的影響程度通過F值反映，F(xiàn)值越大代表該因素的影響程度越大，故各因素對(duì)總黃酮得率的影響次序?yàn)椋禾崛囟龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞料液比。

表4 ANOVA方差分析Table 4 ANOVA for Response Surface Quadratic model

由回歸方程繪制不同因子的響應(yīng)面圖，以評(píng)價(jià)兩兩交互作用對(duì)總黃酮得率的影響并確定各因素的最佳水平范圍，如圖2所示。在響應(yīng)面圖中，曲面越陡峭，則該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。在保持兩個(gè)自變量之外的因素固定的前提下，兩個(gè)交互的自變量對(duì)響應(yīng)值的影響也可以從響應(yīng)面圖的曲面反映[24]。由圖2可知，提取時(shí)間和提取溫度（圖2A），提取時(shí)間和料液比（圖2B）以及提取溫度和乙醇濃度（圖2E）兩者交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，其表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線走勢(shì)陡峭。

圖2 各因素對(duì)總黃酮得率的3D響應(yīng)面圖Fig.2 3D response surface diagram of each factor on total flavonoids yield

通過軟件 Design-Expert 10.0 軟件分析得三葉青總黃酮的最佳提取條件：當(dāng)提取時(shí)間為64.69 min，溫度為82.65 ℃，料液比為1:29.9 g·mL-1，乙醇濃度為59.90%時(shí)，預(yù)測(cè)可達(dá)三葉青總黃酮得率38.01 mg·g-1?？紤]到實(shí)際操作，最終確定最佳提取工藝為提取時(shí)間 65 min，溫度 83 ℃，料液比 1:30 g·mL-1，乙醇濃度60%。此條件下對(duì)建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次，三葉青總黃酮得率為（37.89±0.07） mg·g-1，預(yù)測(cè)值為 38.01 mg·g-1，誤差為 0.32%，小于 3%，表明該響應(yīng)面法得到的預(yù)測(cè)值準(zhǔn)確可靠。該提取工藝總黃酮得率較高，相比朱良輝等[15]在正交工藝優(yōu)化下的總黃酮得率26.04 mg·g-1，有較大的提升，可為進(jìn)一步研究、開發(fā)三葉青藥用資源開發(fā)利用提供參考。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)三葉青總黃酮得率的比較分析

以最佳提取工藝對(duì)不同產(chǎn)區(qū)三葉青樣品進(jìn)行總黃酮提取，平行3次，測(cè)得各產(chǎn)地三葉青總黃酮得率，如圖3所示。其中以云南楚雄、福建福州、貴州黔西南產(chǎn)三葉青的總黃酮得率量較高，分別為51.19、51.75和49.84 mg·g-1；湖南永州、廣東清遠(yuǎn)產(chǎn)三葉青的總黃酮得率較低，均低于25 mg·g-1。各產(chǎn)地三葉青中總黃酮得率差異較大，其原因可能是由于品種差異、地域氣候、生長(zhǎng)年限等因素影響而產(chǎn)生的結(jié)果。

圖3 各產(chǎn)地三葉青總黃酮得率Fig.3 Yield of total flavonoids of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

2.3 不同產(chǎn)地三葉青總黃酮HPLC指紋圖譜建立

將18批各產(chǎn)地三葉青液相色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，共標(biāo)定11個(gè)共有峰，如圖4所示。其中3號(hào)峰、7號(hào)峰在湖南永州和廣東清遠(yuǎn)兩地產(chǎn)三葉青樣品中有缺失；同時(shí)通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)其中3個(gè)成分，確認(rèn)5號(hào)峰為蘆丁，10號(hào)峰為槲皮素，11號(hào)峰為山柰酚。其中5號(hào)峰在江西上饒產(chǎn)三葉青中占比最高，于湖南永州和廣東清遠(yuǎn)兩地產(chǎn)三葉青中占比較低；10（槲皮素）、11（山柰酚）號(hào)峰在云南楚雄產(chǎn)三葉青中占比較高，在江西上饒產(chǎn)三葉青中占比較少。表明該結(jié)果顯示的指紋圖譜中11個(gè)共有峰，可作為三葉青HPLC指紋圖譜特征鑒定指標(biāo)。各樣品色譜圖中均存在5（蘆丁）號(hào)峰，其與鄰峰的分離度較好，峰形較佳，且峰面積較大，故選擇該峰作為參考峰（S），計(jì)算得出18批三葉青共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為 0%～0.21%，但相對(duì)峰面積的 RSD為 23.89%～194.54%，如表5所示。各產(chǎn)地三葉青樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值差異較小，但相對(duì)峰面積的RSD值差異較大，表明不同產(chǎn)地三葉青樣品其化學(xué)成分近似，但同一化學(xué)成分含量差異較大[26]。由指紋圖譜可知浙江臺(tái)州產(chǎn)三葉青各化學(xué)成分最為豐富，且各成分含量也較高；貴州黔西南產(chǎn)三葉青次之；其中以湖南永州與廣東清遠(yuǎn)產(chǎn)三葉青的化學(xué)成分種類與含量最低。同時(shí)由三葉青樣品相似度評(píng)價(jià)表6可知，不同產(chǎn)地三葉青相似度不高，18批三葉青樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.770～0.961。

表6 三葉青樣品相似度評(píng)價(jià)表Table 6 Similarity evaluation table of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

圖4 三葉青樣品HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

表5 三葉青樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積Table 5 Relative retention time and relative peak area of the common peaks of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取S1供試品，連續(xù)進(jìn)樣6次，以槲皮素峰為參考峰，計(jì)算得出各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于0.4%、1.3%，表明該儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1供試品，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得出各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于1.2%、1.8%，表明供試品在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6份S1供試品，分別進(jìn)樣，計(jì)算得出各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于0.9%、2.1%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 不同產(chǎn)地三葉青總黃酮指紋圖譜聚類分析以各產(chǎn)地三葉青11個(gè)共有峰的面積為變量,導(dǎo)入SPSS20.0軟件，采用組間連接聚類方法，以平方Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[27-28]，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)歐氏距離＞10時(shí)，不同產(chǎn)地三葉青可分為 4 類，浙江臺(tái)州（S1，S2）、貴州黔西南（S13，S14）樣品聚為第 1 類，浙江麗水（S3，S4）、云南楚雄（S9，S10）、福建福州（S11，S12）、廣西南寧（S17，S18）樣品聚為第 2 類，湖南永州（S7，S8）、廣東清遠(yuǎn)（S15，S16）樣品聚為第 3 類，江西上饒（S5，S6）單獨(dú)聚為第4類。

圖5 三葉青樣品聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

2.5.2 不同產(chǎn)地三葉青總黃酮指紋圖譜主成分分析和綜合評(píng)價(jià) 以各產(chǎn)地三葉青11個(gè)共有峰的面積為變量，導(dǎo)入SPSS20.0軟件，得到主成分因子載荷矩陣，結(jié)果如表7所示。主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)，載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的重要程度[29-31]。以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，得到3個(gè)主成分，其中主成分F1、F2、F3的貢獻(xiàn)率分別為49.37%、21.30%、14.26%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.92%，表明可以反映樣品大部分的信息，可作為各產(chǎn)地三葉青成分的評(píng)價(jià)指標(biāo)。主成分因子荷載矩陣表中，峰1、2、3、5（蘆?。?、6、7、8、9在主成分 1上有較高載荷，說明主成分1主要反映這8個(gè)成分指標(biāo)信息；同理，主成分2主要反映峰10（槲皮素）、11（山柰酚）這2個(gè)成分指標(biāo)的信息；主成分3主要反映峰4、11（山柰酚）這2個(gè)成分指標(biāo)的信息。以3個(gè)主要成分建立坐標(biāo)系，繪制18批三葉青樣品的得分圖，如圖6所示，表明不同產(chǎn)地三葉青的質(zhì)量存在一定的差異，可將18批三葉青樣品分為4類，其分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

表7 三葉青樣品主成分因子荷載矩陣Table 7 Principal component factor load matrix of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

圖6 三葉青樣品主成分分析得分圖Fig.6 Principal component analysis scores of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

采用3個(gè)主成分得分情況，以各主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，按照公式F=0.4937F1+0.213F2+0.1426F3，計(jì)算綜合得分及排名，如表8所示。結(jié)果表明浙江臺(tái)州樣品中 6、7、9、10（槲皮素）、11（山柰酚）等含量較高，且在各產(chǎn)地樣品綜合得分為31.545，位居第1位，表明浙江臺(tái)州產(chǎn)三葉青質(zhì)量最好。而湖南永州及廣東清遠(yuǎn)樣品不僅各成分含量低，且綜合得分墊底，表明湖南永州和廣東清遠(yuǎn)產(chǎn)三葉青質(zhì)量較差。這3個(gè)產(chǎn)地三葉青樣品主成分得分之間的差異顯著，表明這些成分與三葉青質(zhì)量存在著一定相關(guān)性可以反映各產(chǎn)地三葉青的整體性、差異性，為三葉青藥材的質(zhì)量控制提供更有力的參考依據(jù)。

表8 三葉青樣品主成分得分、綜合得分表Table 8 Principal component scores and comprehensive scores of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了三葉青總黃酮的提取工藝，以比較各產(chǎn)地三葉青總黃酮得率的差異，并運(yùn)用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別對(duì)不同產(chǎn)地三葉青進(jìn)行相似度、聚類、主成分分析及綜合評(píng)價(jià)，可更科學(xué)、全面地評(píng)價(jià)三葉青的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三葉青總黃酮的最佳提取工藝為：提取時(shí)間65 min，溫度83 ℃，料液比1:30 g·mL-1，乙醇濃度60%，此條件下總黃酮得率為37.89 mg·g-1。應(yīng)用上述最佳提取工藝對(duì)不同產(chǎn)地三葉青總黃酮進(jìn)行提取，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地三葉青總黃酮得率差異較大，其中以福建福州、云南楚雄與貴州黔西南的總黃酮得率較高，而湖南永州以及廣東清遠(yuǎn)的三葉青總黃酮得率較低。同時(shí)本研究?jī)?yōu)化液相色譜條件，建立各產(chǎn)地三葉青HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定11個(gè)共有峰，并指認(rèn)出5號(hào)峰為蘆丁，10號(hào)峰為槲皮素，11號(hào)峰為山柰酚。相似度分析結(jié)果表明，18批三葉青樣品的相似度范圍為0.770～0.961，說明不同產(chǎn)地之間三葉青樣品具有一定的差異性。聚類分析與主成分分析結(jié)果一致顯示，18批三葉青樣品可聚為4類。綜合評(píng)價(jià)結(jié)果得出，9個(gè)產(chǎn)地三葉青中，以浙江臺(tái)州質(zhì)量最佳，其次是云南楚雄、福建福州，廣東清遠(yuǎn)質(zhì)量最差。由以上結(jié)果可知，總黃酮得率較高的福建福州、云南楚雄的綜合評(píng)價(jià)排名靠前，而總黃酮得率較低的湖南永州、廣東清遠(yuǎn)的綜合排名墊底，表明綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果與各產(chǎn)地三葉青總黃酮的得率有一定的相關(guān)性。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步增加總黃酮、多糖等其他成分測(cè)定，并通過功效、口感風(fēng)味等對(duì)三葉青進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)，以期為三葉青的優(yōu)良品種選育、總體品質(zhì)提升與資源開發(fā)利用提供一定的參考。