煙草C4H2基因的克隆與表達(dá)特性分析

劉晨，王禎，朱先約，王文婷，黃申，翟玉俊

1.甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730050；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

烤煙致香前體物質(zhì)種類繁多，多酚類化合物尤為重要，在一定程度上決定著烤煙的香氣風(fēng)格[1]；同時，在煙葉生長、醇化和吸食燃燒過程中，其黃酮類化合物蕓香苷的含量同樣會直接影響烤煙的香氣質(zhì)量[2]。有研究表明,黃酮類化合物是影響煙草內(nèi)在品質(zhì)最為關(guān)鍵的因素之一，其含量大小對植株生長發(fā)育過程中所參與的防御、抗逆機(jī)制起到至關(guān)重要的作用[3-5]。

肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)是多酚類化合物苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其作用是將苯丙氨酸催化為香豆酸，香豆酸再經(jīng)過4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaroyl CoA Ligase,4CL)處理，進(jìn)一步生成香豆酰輔酶A。研究表明，植物中黃酮類化合物、木質(zhì)素、芳香族類化合物合成等多條代謝途徑會隨著C4H蛋白質(zhì)活性和轉(zhuǎn)錄豐度的變化而發(fā)生變化[6]。大豆中C4H 蛋白的減少會直接導(dǎo)致苯丙烷類物質(zhì)含量明顯降低，木質(zhì)化進(jìn)程受阻，嚴(yán)重干擾植物正常的生長發(fā)育[7]。因此，C4H蛋白在植物細(xì)胞中的含量變化會對植株生長發(fā)育過程中木質(zhì)素和黃酮類物質(zhì)合成的多條代謝支路產(chǎn)生直接影響[8]。

目前，C4H 蛋白家族成員中的C4H2基因已在擬南芥、大豆、桂花等多種植物中進(jìn)行了克隆研究[9-12]。于利等[13]利用同源克隆技術(shù)成功從煙草中克隆出C4H基因家族，比較了C4H1與C4H2在HD和K326兩個煙草品種各組織器官及不同生育期中部葉中的表達(dá)差異性。但關(guān)于C4H2基因在煙草中的遺傳組成、表達(dá)特性和作用方式等更為細(xì)致、完整的研究尚未見報道，其基因表達(dá)量與煙草中黃酮含量的相關(guān)性也有待研究。

鑒于此，本文擬通過對煙草C4H2基因進(jìn)行克隆、序列分析，進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建、純化，實現(xiàn)其體外融合表達(dá)并進(jìn)行表達(dá)檢測，以探究在激素誘導(dǎo)調(diào)控下不同組織NtC4H2(煙草C4H2)基因的表達(dá)水平與總黃酮含量變化趨勢的相關(guān)性，為該基因在煙草黃酮類化合物生物合成中的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

中煙202及其無菌幼苗，來自甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司分子生物學(xué)實驗室。

主要儀器：QIAcube核酸提取儀、QIAxceL Advanced全自動電泳分析儀，德國Qiagen公司產(chǎn)；Qubit熒光定量儀，美國 Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)；LightCycler 96熒光定量PCR儀，美國 Roche公司產(chǎn)；水平電泳儀、Geldoc EZ凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司產(chǎn)；PCR儀、離心機(jī)、德國Eppendorf公司產(chǎn)；MiniSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司產(chǎn)；HD3100超聲波細(xì)胞破碎儀，德國 WIGGENS公司產(chǎn)；Cary60紫外分光光度計，美國 Agilent公司產(chǎn)。

主要試劑：RNeasy Plant Mini Kit，德國Qiagen公司產(chǎn)；1st Stand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq Hot Start Version、PCR Mix，日本TaKaRa公司產(chǎn)；Mini Seq High Output Library Prep Kit，美國Illumina公司產(chǎn)；EDTA，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)；胰蛋白胨、酵母抽提物，英國Oxoid公司產(chǎn)；IPTG，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA合成總 RNA 的提取。稱取0.2 g中煙202無菌幼苗葉片組織，加無菌水清洗；液氮研磨；加入1 mL TRizol，混勻轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中；加200 μL 氯仿，混勻，12 000 r/min離心15 min；移取上清，加600 μL 異丙醇，充分混勻，于-20 ℃靜置45 min后，12 000r/min離心15 min；棄上清，加1 mL RNA專用體積分?jǐn)?shù)為75%的預(yù)冷乙醇，混勻，12 000 r/min離心10 min；室溫下靜置10～15 min，使RNA 適度干燥；用不含RNase的去離子水溶解，取2 μL 測定濃度。

cDNA合成。合成反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 0.5 μg，Nuclease-free water補(bǔ)足10 μL；反應(yīng)參數(shù)為42 ℃、2 min。逆轉(zhuǎn)錄體系：去基因組反應(yīng)液10 μL，5×primer Script Buffer 4 μL，RT Enzyme Mix1 1 μL，RT primer 1 μL，Nuclease-free water補(bǔ)足20 μL；反應(yīng)參數(shù)為37 ℃、60 min，85 ℃、5 s。以得到的cDNA為模板，進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.2.2 煙草C4H2-CDS區(qū)的克隆根據(jù)NCBI馬鈴薯C4H2基因序列(ABC69 046.1)篩選出CDS區(qū)序列，使用DNAStar軟件設(shè)計特異性引物，引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers used in the NtC4H2 cloning

PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板 5 μL，Primer Mix 2 μL，LA TAQ PCR Mix 10 μL，Nuclease-free water 3 μL，補(bǔ)充dd H2O至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，55 ℃、40 s，72 ℃、60 s，40 cycle；72 ℃、10 min；4 ℃保存。將上述目標(biāo)CDS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳割膠回收后進(jìn)行TA克隆，與大腸桿菌Top10連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆。使用MiniSeq High Output Library Prep Kit 試劑盒，在IlluminaMiniSeq 高通量測序平臺上進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析利用DNAMAN 7分析預(yù)測NtC4H2基因編碼的蛋白并進(jìn)行同源序列比對；ProtParam和ProtScaLe用于氨基酸理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)親/疏水性分析；SignalP用于分析蛋白是否含有信號肽；TMHMMserver2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析和預(yù)測；PredictProtein和CD search對蛋白質(zhì)的保守域和功能位點進(jìn)行分析；SOPMA和SWISS-MODEL分別用于蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的分析、預(yù)測。

1.2.4NtC4H2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)NtC4H2基因的測序結(jié)果和生物信息學(xué)分析結(jié)果，將鑒定為陽性克隆的菌落進(jìn)行T-C4H2-CDS質(zhì)粒抽提，并與pET22b質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：質(zhì)粒1 μg；10×H 3 μL；XhoⅠ1 μL；EcoRⅠ1 μL；dd H2O補(bǔ)齊至30 μL。分別把雙酶切后的載體pET22b和C4H2-CDS片段割膠回收，用T4 DNA Ligase將雙酶切后的載體片段和目的基因片段于16 ℃連接2 h，將連接的產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，均勻涂布在LB平板 (含50 μg/mL氨芐青霉素，下同)上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑單克隆搖菌提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ對得到的pET22b-C4H2-CDS質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，通過酶切鑒定出正確的克隆并進(jìn)行測序。

1.2.5 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化挑取3個含pET22b-C4H2-CDS質(zhì)粒的BL21(DE3)菌體單斑至2 mL LB中37 ℃過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后將菌液與水按1∶50的體積比稀釋后，取0.1 mL稀釋菌液加入到含5 mL LB培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 ～ 0.8。然后加入1 mM/L的IPTG誘導(dǎo)劑30 ℃過夜培養(yǎng)。誘導(dǎo)后，取菌液1 mL，12 000 r/min離心30 s,收獲沉淀，用5×蛋白Loading buffer重懸，混勻，100 ℃水浴10 min，然后進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳分析。適度擴(kuò)大培養(yǎng)體積，使用超聲裂解菌體，裂解后離心、取沉淀，溶于含有8 mol/L 尿素的結(jié)合緩沖液中，采用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組蛋白。

1.2.6NtC4H2基因的表達(dá)特性及酶活性測定

RT-PCR按SYBR Premix Ex Taq試劑盒的操作說明進(jìn)行。以26 s作為內(nèi)參。反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10 μL，Nuclease-free water 3 μL，Primer Mix 2 μL，cDNA 5 μL，終體積20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 cycle。每份樣品設(shè)6次重復(fù)，采用比較CT值的2-ΔΔCT方法分析基因的表達(dá)量[14]。肉桂酸-4-羥化酶活性測定參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行，測定波長為340 nm，OD值每1 h變化0.01為一個酶活性單位/U。

1.2.7NtC4H2基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析及黃酮類物質(zhì)的測定采用RT-PCR分析經(jīng)茉莉酸甲酯(MEJA)分別處理0 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h的上部葉NtC4H2基因表達(dá)量，每份樣品設(shè)6次重復(fù)。采用紫外分光光度法測定MEJA誘導(dǎo)后的各上部葉片總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程，重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用Origin 9.0進(jìn)行單因素方差分析[16-17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 NtC4H2基因的克隆及測序結(jié)果分析

NtC4H2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，其中，M為DNA Marker，1、2為NtC4H2基因擴(kuò)增結(jié)果。由圖1可知，NtC4H2基因序列長度為1500 bp左右，對割膠回收后的基因片段進(jìn)行測序，得到序列長度為1521 bp，NtC4H2基因序列全長如圖2所示。將得到的基因序列與Gene Bank中已登錄的普通煙草(Nicotianatabacum/common tobacco)C4H2基因序列(DQ350353.1)進(jìn)行比對，顯示相似度達(dá)94.67%。因此可以確定得到的基因序列為C4H2基因序列。

圖1 NtC4H2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of NtC4H2 gene

圖2 NtC4H2基因序列全長Fig.2 Full length of NtC4H2 gene sequence

2.2 NtC4H2蛋白的生物信息學(xué)結(jié)果分析

煙草NtC4H2蛋白與其他植物C4H蛋白的多序列比對結(jié)果如圖3所示，其中，紅框為P450保守序列區(qū)域，下劃線為特征性底物結(jié)合位點。由圖3可知，NtC4H2蛋白與美花煙草(Nictianasylvestris)C4H蛋白(XP-009766429.1)、普通煙草C4H2蛋白、矮牽牛(Petuniaxhybrida)PhC4H2蛋白(F1B283.1)相似性最高，達(dá)98%；與番茄(Solanumpennellii)C4H蛋白(XP_015078931.1)、龍葵(Solanumnigrum)C4H蛋白(QIC52990.1)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)C4H蛋白(ABC69046.1)等相似度達(dá)85%以上。煙草NtC4H2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，美花煙草、普通煙草、矮牽牛、番茄、龍葵、馬鈴薯、枸杞(Lyciumchinense)、辣椒(Capsicumannuum)、大花牽牛(Ipomoeanil)的C4H蛋白與煙草NtC4H2蛋白均處于同一進(jìn)化支，表明其親緣關(guān)系較近。煙草NtC4H2蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析與預(yù)測結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，NtC4H2蛋白符合細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)域特征，具有P450保守序列，是細(xì)胞色素P450超家族成員；NtC4H2蛋白序列中共有20個功能位點，酰胺化位點1處、酰基化位點6處，糖基化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶II磷酸化位點分別為2處、7處、4處；有5個特征性底物結(jié)合位點(substrate recognition sites)SRS1、SRS2、SRS4、SRS5和SRS6，其中序列241和277處不含二硫鍵[18]。

圖3 煙草NtC4H2蛋白與其他植物C4H蛋白的多序列比對結(jié)果Fig.3 Multiple comparison of amino acid sequence between NtC4H2 protein in tobacco and C4H protein in other plant species

圖4 煙草NtC4H2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果Fig.4 Phylogenetic tree of NtC4H2 protein in tobacco

圖5 煙草NtC4H2蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析與預(yù)測結(jié)果Fig.5 Analysis and prediction of secondary structure of NtC4H2 protein

預(yù)測顯示其分子式為C2660H4204N722O727S16，相對分子質(zhì)量和理論pI等電點值分別為58.44 kD和9.26，總原子數(shù)8329個，由506個氨基酸編碼其蛋白質(zhì)，帶正、負(fù)電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)、(Asp+Glu)分別為72個和62個，其中亮氨酸(Leu)含量最高，達(dá)11.1%；其次是纈氨酸(Val)和谷氨酸(Glu)均為7.7%；半胱氨酸(Cys)含量達(dá)到最低，僅為0.4%，這種氨基酸比例可能與NtC4H2蛋白的功能結(jié)構(gòu)和酶學(xué)特性有關(guān)。分析表明這種蛋白不穩(wěn)定，系數(shù)為46.21，其半衰期30 h、脂肪系數(shù)為96.66。對其親/疏水性的分析表明NtC4H2蛋白為親水蛋白，總平均吸水性為-0.264。

信號肽預(yù)測顯示NtC4H2蛋白有信號肽的概率是0.048 9，表明該蛋白質(zhì)C、Y、S的值均低于0.2，說明其不含信號肽。該蛋白在N末端第5位到第24位氨基酸區(qū)域組成了1個跨膜區(qū)，且在膜外，跨膜區(qū)域占比3.95%。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、分析結(jié)果顯示：煙草NtC4H2蛋白中參與α螺旋的氨基酸(藍(lán)色)、延伸鏈(紅色)、β轉(zhuǎn)角的氨基酸(綠色)和無規(guī)則卷曲的氨基酸(黃色)分別有240個、74個、26個、166個，它們的占比分別達(dá)47.43%、14.62%、5.14%和32.81%。

煙草NtC4H2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測以數(shù)據(jù)庫中高粱(Sorghumbicolor)C4H2蛋白結(jié)構(gòu)為模板，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，預(yù)測空間結(jié)構(gòu)一致性達(dá)75.5%，共涵蓋了32～503個氨基酸，相似度為0.54，覆蓋度為0.98，三級結(jié)構(gòu)總體評價0.86，Qmean為-1.99。根據(jù)預(yù)測結(jié)果顯示,煙草NtC4H2蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)目與和生物學(xué)功能與二級結(jié)構(gòu)相一致，可能以單體的形式在植株中發(fā)揮作用。

圖6 煙草NtC4H2蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.6 Prediction of tertiary structure of NtC4H2 protein

2.3 煙草NtC4H2原核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果分析

煙草NtC4H2原核表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果如圖7所示，其中,M為DNA Marker,1為雙酶切鑒定結(jié)果。由圖7可知，載體條帶和目的基因條帶大小分別約為5000 bp和1500 bp。將雙酶切鑒定正確的單克隆進(jìn)行測序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET-22b-C4H2-CDS中NtC4H2基因的序列與目的基因中的CDS區(qū)序列一致，并且未出現(xiàn)堿基突變、插入缺失等情況，表明原核表達(dá)載體pET-22b-C4H2-CDS構(gòu)建成功。

圖7 煙草NtC4H2原核表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果Fig.7 Identification of tobacco expression vector pET-22b-C4H2-CDS with double digestion

2.4 煙草NtC4H2重組蛋白的原核表達(dá)與純化結(jié)果分析

誘導(dǎo)前后大腸桿菌總蛋白 SDS-PAGE分析結(jié)果如圖8所示，其中，M為Protein marker；1、3、5為誘導(dǎo)前；2、4、6為誘導(dǎo)后；箭頭表示NtC4H2重組蛋白。由圖8可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在約70 kD處出現(xiàn)較明顯的目的蛋白條帶。NtC4H2蛋白在進(jìn)行原核表達(dá)時，其蛋白N-末端會與pET-22b載體的標(biāo)簽序列(His-Tag)進(jìn)行一定的融合，其分子質(zhì)量大小約為75 kD，這與試驗結(jié)果保持一致。含pET-22b空載體的菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，未在70 kD處出現(xiàn)條帶。

圖8 誘導(dǎo)前后大腸桿菌總蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant NtC4H2 protein

重組蛋白純化分析結(jié)果如圖9所示，其中，M為Protein marker；1為純化前；2為純化后；箭頭表示NtC4H2重組蛋白。由圖9可知，NtC4H2蛋白在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)，并獲得純化NtC4H2重組蛋白。重組蛋白NtC4H2主要以不溶性包涵體形式存在，這可能是由于原核表達(dá)中目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯誤的折疊，聚集發(fā)展為包涵體所導(dǎo)致；大腸桿菌在進(jìn)行表達(dá)時沒有NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶來催化C4H2蛋白，這也會造成CYP450蛋白失活后以包涵體的形式存在。試驗中通過重組蛋白上的表達(dá)序列標(biāo)簽，利用Ni柱即可純化回收目的蛋白，靶蛋白通常占細(xì)胞總蛋白的50%以上。雖然有一定比例的蛋白以可溶的形式存在，但多達(dá)95%(甚至可以更多)的蛋白則在包涵體中。包涵體的形成是靶蛋白高表達(dá)的標(biāo)志，通?？梢悦庥诘鞍酌傅乃馄茐淖饔?。

圖9 重組蛋白純化分析結(jié)果Fig.9 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein

2.5 煙草NtC4H2基因的表達(dá)特征及酶活性測定結(jié)果分析

煙草NtC4H2基因在不同組織中的表達(dá)分析及酶活變化如圖10所示。由圖10a)可知，NtC4H2基因在各個組織中的表達(dá)豐度存在較大差異，在煙草幼苗上部葉中相對表達(dá)量最大，為28.7；下部葉表達(dá)量最小，為20.7；相對表達(dá)量由少至多依次為下部葉<莖<中部葉<根<上部葉。由圖10b)可知，酶活性變化趨勢與NtC4H2基因在不同組織中的表達(dá)水平一致。

圖10 煙草NtC4H2基因在不同組織中的表達(dá)分析及酶活變化Fig.10 Expression analysis of NtC4H2 gene in different tissues and enzyme activity

于利等[13]對HD、K326 兩個煙草品種不同部位的組織表達(dá)特性對比后發(fā)現(xiàn)，C4H2基因在HD根部的表達(dá)水平最高，下部葉表達(dá)水平最低，整體表達(dá)情況為為下部葉<上部葉<中部葉<根，而K326則表現(xiàn)為中部葉<下部葉<根<上部葉。這些結(jié)論與本研究結(jié)果對比顯示，中煙202中NtC4H2基因的表達(dá)模式、表達(dá)量與HD、K326均存在一定差異。這種差異的產(chǎn)生一方面可能是植株品種間的差異造成的，另一方面則與試驗植株所處不同生命階段對其木質(zhì)化進(jìn)程相關(guān)。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的組成成分之一，植物木質(zhì)化進(jìn)程是指木質(zhì)素在植物細(xì)胞壁中大量沉淀、積累。有研究表明C4H蛋白會與其他酶形成多酶復(fù)合體的構(gòu)造，這種構(gòu)造有助于控制木質(zhì)素的生成[19-20]。當(dāng)植株隨著自身生長發(fā)育對于木質(zhì)素的需求量逐漸增加時，其基因表達(dá)量也會發(fā)生變化。本試驗煙草植株處于生命活動初期，是植株快速生長的階段。試驗結(jié)果顯示上部葉中NtC4H2基因含量高于中部和下部，這可能由于幼苗期植株在頂端優(yōu)勢的作用下經(jīng)過分生組織不斷的細(xì)胞分裂、分化、伸長，頂部細(xì)胞壁加厚，合成大量木質(zhì)素，導(dǎo)致植株快速生長、加粗。這一系列組織變化過程同時伴隨煙草下部葉中細(xì)胞增殖和伸長停止，大量細(xì)胞壁會同時出現(xiàn)沉積現(xiàn)象，從而使處于下部葉中的細(xì)胞木質(zhì)化能力減弱[21-23]。這些研究與本試驗結(jié)果一致，即下部葉中NtC4H2基因表達(dá)量可能低于上部、中部葉。與此同時，有研究[24]表明，大蒜幼苗中C4H的轉(zhuǎn)錄在根中最高，在莖中卻很低。推測可能是由于大蒜中苯丙烷類物質(zhì)在根中進(jìn)行了大量合成、積累后轉(zhuǎn)運(yùn)到莖中。這也與本試驗中NtC4H2基因定量檢測結(jié)果一致，即根中的表達(dá)量相對高于莖中。

2.6 MEJA誘導(dǎo)表達(dá)及黃酮類物質(zhì)的測定結(jié)果分析

上部葉中NtC4H2基因在茉莉酸甲酯激素處理下的表達(dá)分析結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，經(jīng)過MEJA誘導(dǎo)后，在不同采樣時間內(nèi)NtC4H2基因表達(dá)量均有明顯波動。在前48 h的采樣時間內(nèi)，除4 h表達(dá)量略有下降外，之后的3個采樣時間點表達(dá)量均呈現(xiàn)緩慢升高趨勢。24 h表達(dá)量為0 h表達(dá)量的1.36倍，在48 h時NtC4H2基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，是0 h表達(dá)量的1.58倍。72 h后NtC4H2的表達(dá)量又呈現(xiàn)出回落趨勢。

圖11 上部葉中NtC4H2基因在茉莉酸甲酯激素處理下的表達(dá)分析結(jié)果Fig.11 Expression analysis of NtC4H2 gene in upper leaves treated with MEJA

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及不同時間茉莉酸甲酯處理上部葉中黃酮含量分析結(jié)果如圖12所示。由圖12可知，經(jīng)MEJA誘導(dǎo)后NtC4H2的表達(dá)模式可能與葉中黃酮的積累有關(guān)，對照組在6個采樣時間點中黃酮含量沒有明顯變化，而MEJA處理組在4 h時黃酮含量升高至9.34 mg/g DW，比0 h時升高了27.78%；在12 h時黃酮含量比4 h略有降低，為8.81 mg/g DW。在24 h時黃酮含量升高至9.96 mg/g DW；48 h時達(dá)到峰值，為13.19 mg/g DW，比對照組提高80.19%。當(dāng)MEJA處理72 h后，黃酮含量開始下降，為6.47 mg/g DW，比對照組下降了11.49%。MEJA處理組黃酮含量總體變化趨勢呈現(xiàn)先升高后下降的態(tài)勢。

圖12 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及不同時間茉莉酸甲酯處理上部葉中黃酮含量分析結(jié)果Fig.12 The standard curve of rutin and analysis of flavonoid content in upper leaves treated with MEJA at different time

MEJA是植物體內(nèi)廣泛存在的激素，其作為信號源參與到植物的各個抗逆過程。MEJA也會增加植物次生代謝產(chǎn)物的積累，它可以誘導(dǎo)合成三萜類化合物，同時提高黃酮類物質(zhì)含量[25-27]。研究表明，短期脅迫有利于黃酮類化合物的合成和積累，有利于提高 PAL 和 C4H 等酶的活性[28]。M.H.Ibrahim等[29]研究發(fā)現(xiàn)，過高的施氮量會使C4H酶活性適度下調(diào)，使得一些黃酮類化合物的含量隨之下降；黃利娜等[30]研究與其結(jié)果一致，即外源NO處理會抑制蓮霧果實中C4H表達(dá)水平和木質(zhì)素的積累。而王愛華等[31]研究表明，在烤煙的上部葉片中，施加適量的純氮，在一定程度上可以使C4H 酶活性以及黃酮類化合物的含量有效增加。同時在轉(zhuǎn)DfC4H基因香鱗毛蕨T1代植株中，黃酮類化合物合成途徑的終產(chǎn)物花色素苷的含量明顯高于野生型[32]。馮藝川等[33]研究膜莢黃芪AmC4H2基因時發(fā)現(xiàn)，在根、莖、葉中該基因的表達(dá)趨勢與毛蕊異黃酮及其糖苷的含量基本一致，因此推測其參與了毛蕊異黃酮及其糖苷的生物合成。這些研究結(jié)果都與本試驗結(jié)果一致。當(dāng)煙草植株檢測到外界MEJA激素信號時，由信號傳導(dǎo)開啟自身抗逆機(jī)制，體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物開始逐步積累以抵御和適應(yīng)外界的不良環(huán)境。本研究通過檢測經(jīng)MEJA誘導(dǎo)不同時間后煙草上部葉中NtC4H2基因的表達(dá)量和黃酮含量，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)規(guī)律與黃酮含量變化趨勢相同。驗證了基因NtC4H2與煙草植株黃酮類物質(zhì)的生物合成具有一定相關(guān)性。

3 結(jié)論

本文從煙草中克隆出長度為1521 bp(CDS)的NtC4H2基因，經(jīng)分析顯示共編碼506個氨基酸，與美花煙草C4H蛋白、普通煙草C4H2蛋白和矮牽牛C4H2蛋白相似性最高達(dá)98%；與番茄、龍葵、馬鈴薯等植物C4H蛋白相似度達(dá)85%以上。NtC4H2蛋白是細(xì)胞色素P450 超家族成員，具有P450保守序列，有1個跨膜區(qū)，為不穩(wěn)定親水蛋白，二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成。通過構(gòu)建pET-22b-C4H2-CDS表達(dá)載體，重組、純化了NtC4H2蛋白，重組NtC4H2蛋白主要以不溶性包涵體的形式存在于表達(dá)細(xì)菌中。NtC4H2基因在煙草不同組織中進(jìn)行表達(dá)，C4H2酶活性的大小與基因的表達(dá)水平一致，依次為下部葉<莖<中部葉<根<上部葉。不同組織表達(dá)量與誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示，經(jīng)MEJA誘導(dǎo)后NtC4H2基因在煙草上部幼葉中的表達(dá)量呈先高升后降低的趨勢，在48 h時表達(dá)量達(dá)到峰值且與葉中黃酮物質(zhì)的積累呈正相關(guān)。