通脈養(yǎng)心丸治療不同性別老年冠心病患者的分子機(jī)制研究

李子瀅，王國佐，黃娟，秦莉花，，李晟

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病又稱冠心病，是冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化病變而引起的血管管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死的一種心臟病。美國心臟病協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2011—2014年美國≥20歲成年人冠心病總患病率為6.3%，2015年美國冠心病死亡人數(shù)達(dá)366 801例；推測2018年美國約72萬人將首發(fā)冠心病，33.5萬人將復(fù)發(fā)冠心病；在發(fā)達(dá)與不發(fā)達(dá)國家，冠心病仍是造成死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅人類的生命及身體健康［1］。目前，中國心血管疾病患病率及死亡率仍處于上升階段，位居城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，2018年中國心血管疾病患病人數(shù)已高達(dá)3.3億［2-3］。在過去的20年里，越來越多的證據(jù)表明心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)存在性別差異，女性冠心病發(fā)病時(shí)間較男性晚10～15年，女性冠心病發(fā)生率在絕經(jīng)前僅是男性的1/10～3/10，絕經(jīng)后則迅速升高［4］。與男性冠心病患者相比，女性冠心病患者心血管復(fù)合終點(diǎn)事件和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)均較低，但心力衰竭、全因死亡率較高［5］。故關(guān)注冠心病的性別差異具有一定的臨床意義。

專利藥物通脈養(yǎng)心丸在中國已被廣泛用于治療冠心病，其抗炎作用是治療冠心病的潛在機(jī)制之一［6］，但其具體的作用機(jī)制仍不清楚。本研究采用生物信息學(xué)方法分析通脈養(yǎng)心丸治療不同性別老年冠心病患者的分子機(jī)制，以期為冠心病的治療和中藥復(fù)方的研發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的獲取 2021年6—10月，從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus datasets，GEO）下載GSE142008數(shù)據(jù)集，平臺(tái)號(hào)為GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。本研究從GSE142008數(shù)據(jù)集選取老年冠心病患者12例，年齡≥60歲。將治療前3例女性患者、3例男性患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本作為對(duì)照組，通脈養(yǎng)心丸治療后3例女性患者、3例男性患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本作為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異基因的篩選 采用R 3.6.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析與可視化。使用ggplot2包（3.3.3版本）繪制樣本數(shù)據(jù)歸一化的箱式圖。差異基因的篩選參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為|log2（FC）|＞1，校正P值＜0.05。使用ComplexHeatmap包（2.2.0版本）繪制熱圖［7］，以直觀地展示各差異基因在每個(gè)樣本中的表達(dá)情況；使用ggplot2包（3.3.3版本）繪制數(shù)據(jù)火山圖，以直觀地展示差異基因的分布情況。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）的制作及關(guān)鍵基因的選取 參考文獻(xiàn)［8］，利用STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org）對(duì)差異基因制作PPI，蛋白互作分?jǐn)?shù)閾值為0.40，將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件（3.8.2版本）中的MCODE、cytoHubba插件以篩選基因，再利用韋恩圖在線工具將篩選出來的基因進(jìn)行對(duì)比以獲得關(guān)鍵基因。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 使用R 3.6.3軟件進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中org.Hs.eg.db包（3.10.0版本）用于ID轉(zhuǎn)換，clusterProfiler包（3.14.3版本）［9］用于富集分析，ggplot2包（3.3.3版本）用于可視化及可視化網(wǎng)絡(luò)圖制作。以校正P值＜0.05、q值＜0.2為閾值篩查差異基因的主要富集功能和通路。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果 各個(gè)樣本中位數(shù)基本在一個(gè)水平線上，提示樣本間歸一化程度好，見圖1。

圖1 不同性別老年冠心病患者樣本數(shù)據(jù)的箱式圖Figure 1 Box plot of sample data of elderly patients with coronary heart disease of different genders

2.2 差異基因篩選結(jié)果 老年女性冠心病患者治療前后比較差異基因有796個(gè)，其中高表達(dá)776個(gè)、低表達(dá)20個(gè)；老年男性冠心病患者治療前后比較差異基因有1 159個(gè)，其中高表達(dá)1 117個(gè)、低表達(dá)42個(gè)，見表1、圖2～3。

圖2 不同性別老年冠心病患者差異基因的火山圖Figure 2 Volcano plot of differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

圖3 不同性別老年冠心病患者差異基因的熱圖Figure 3 Thermogram of differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

表1 不同性別老年冠心病患者治療前后比較排名前10位的上調(diào)和下調(diào)差異基因Table 1 The top 10 up-regulated and down-regulated differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders before and after treatment

2.3 PPI及關(guān)鍵基因選取結(jié)果 在老年女性冠心病患者中，MCODE插件分析結(jié)果顯示，一共有16個(gè)聚類，選擇分?jǐn)?shù)最高的聚類1，得分為25分、節(jié)點(diǎn)為25個(gè)、邊數(shù)為300條，篩選出的基因?yàn)長ONRF1、FBXL3、LTN1、KBTBD7、UBE2E1、UBE2Q2、UBE2J1、FBXL5、HACE1、RNF6、UBE2W、RNF138、BTBD1、UBA3、TCEB1、CUL5、UBE2V2、MEX3C、FBXO11、ZNRF2、RCHY1、UBR1、PJA2、UFL1、RNF14，見圖4A；cytoHubba插件分析結(jié)果顯示，按照得分由高到低的基因依次為BTBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1，見圖5A。最終選取的關(guān)鍵基因?yàn)锽TBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1。

在老年男性冠心病患者中，MCODE插件分析結(jié)果顯示，一共有25個(gè)聚類，選擇分?jǐn)?shù)最高的聚類1，得分為34分、節(jié)點(diǎn)為34個(gè)、邊數(shù)為561條，篩選的基因?yàn)镵CTD6、FBXL5、RCHY1、UBE2E1、FBXW7、UBE2Q2、UBE2J1、CUL3、SIAH1、UBE2V2、HACE1、BTBD1、RNF111、RNF138、KLHL2、UBE2W、MEX3C、UBE2D1、LONRF1、ANAPC4、HERC4、CUL5、PJA2、RNF6、KBTBD6、KBTBD7、UBE2A、UFL1、UBA3、LTN1、KLHL9、UBR1、ARIH2、FBXL3，見圖4B；cytoHubba插件分析結(jié)果顯示，按照得分由高到低的基因依次為PJA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1，見圖5B。最終選取的關(guān)鍵基因?yàn)镻JA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1。

圖4 MCODE插件分析結(jié)果Figure 4 Analysis results of MCODE plugin

圖5 cytoHubba插件分析結(jié)果Figure 5 Analysis results of cytoHubba plugin

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 在老年女性冠心病患者中，GO功能富集分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因主要富集于翻譯后的蛋白質(zhì)修飾、蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程等生物過程；泛素連接酶復(fù)合物、cullin-RING泛素連接酶復(fù)合物等細(xì)胞組成；泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、泛素蛋白連接酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因主要與泛素介導(dǎo)的蛋白水解、晝夜節(jié)律通路相關(guān)，見表2、圖6A、圖7A。

在老年男性冠心病患者中，GO功能富集分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因主要富集于蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程、蛋白酶體蛋白質(zhì)分解代謝過程等生物過程；泛素連接酶復(fù)合物、cullin-RING泛素連接酶復(fù)合物等細(xì)胞組成；泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因主要與泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路相關(guān)，見表2，圖6B、圖7B。

圖6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的柱狀圖Figure 6 Histogram of GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

圖7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的可視化網(wǎng)絡(luò)圖Figure 7 Visual network diagram of GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

表2 不同性別老年冠心病患者關(guān)鍵基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果Table 2 GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

3 討論

冠心病歸屬于中醫(yī)學(xué)“心痛”“胸痹”等范疇，中醫(yī)藥運(yùn)用于冠心病臨床治療的歷史悠久且療效顯著，應(yīng)用前景廣闊［10］。通脈養(yǎng)心丸源于兩大經(jīng)典方劑炙甘草湯和生脈散，其由地黃、雞血藤、甘草、五味子、麥冬等中藥材組成，具有益氣養(yǎng)陰、通脈止痛的功效，臨床上用于治療胸痛、心痛、氣陰兩虛型冠心病等［11］。既往研究表明，通脈養(yǎng)心丸可通過保護(hù)心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎性因子表達(dá)等有效治療冠心病，但其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究［12］。因此，研究通脈養(yǎng)心丸治療冠心病的分子機(jī)制，對(duì)冠心病的臨床治療及通脈養(yǎng)心丸的推廣和二次開發(fā)具有重要的臨床意義。

本研究以治療前患者外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本為對(duì)照組，通脈養(yǎng)心丸治療后患者外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本為實(shí)驗(yàn)組，最終篩選出關(guān)鍵基因，結(jié)果顯示，老年女性冠心病患者的關(guān)鍵基因?yàn)锽TBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1；老年男性冠心病患者的關(guān)鍵基因?yàn)镻JA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1。通脈養(yǎng)心丸可能主要通過調(diào)控以上基因的表達(dá)來治療冠心病。BTBD1是一種含有BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白，與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1相互作用，參與肌生成的過程和泛素/蛋白酶體降解途徑，該過程和途徑與心血管疾病密切相關(guān)［13］。FBXL5被鑒定為SCF泛素連接酶復(fù)合物的底物受體亞基，缺乏FBXL5表達(dá)的細(xì)胞無法識(shí)別其鐵代謝狀態(tài)，從而不斷積累有毒的生物可利用鐵［14］，而高水平的儲(chǔ)存鐵能夠增加冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［15］。KBTBD7參與炎性因子的表達(dá)調(diào)控，能夠抑制炎癥反應(yīng)［16］，而炎癥因子及炎癥反應(yīng)與冠心病發(fā)病有關(guān)。FBXL3是SCF泛素連接酶復(fù)合物的一部分，主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，其可以通過與隱花色素蛋白結(jié)合來影響負(fù)反饋環(huán)，加速哺乳動(dòng)物的SCF復(fù)合物介導(dǎo)的多泛素化和隨后的蛋白酶體降解，從而維持哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律［17］。FBXO11屬于泛素連接酶E3家族，有研究表明，F(xiàn)BXO11可以通過破壞缺氧誘導(dǎo)因子1α mRNA來抑制細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)［18］。本研究認(rèn)為，通脈養(yǎng)心丸可通過FBXO11在心肌細(xì)胞缺氧過程中起保護(hù)作用，從而影響冠心病的疾病進(jìn)程和患者預(yù)后。CUL5是泛素連接酶復(fù)合物中的一種支架蛋白，其介導(dǎo)的內(nèi)脂素可以保護(hù)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷［19］。TCEB1即轉(zhuǎn)錄延伸因子B1，有研究表明，TCEB1是多囊卵巢綜合征的潛在治療靶點(diǎn)，而多囊卵巢綜合征可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病［20］。UBA3可以抑制抗凝血酶的泛素化和降解，增加抗凝血酶蛋白表達(dá)水平［21］。LTN1通過靶向異常的新生多肽進(jìn)行蛋白酶體降解，在核糖體相關(guān)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)［22］。但目前尚未發(fā)現(xiàn)LTN1與冠心病之間的關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)其是冠心病相關(guān)的新基因，但其具體作用及機(jī)制還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。UBR1屬于E3泛素連接酶家族，對(duì)于心臟的發(fā)育至關(guān)重要，其缺陷會(huì)導(dǎo)致心血管的異常［23］。PJA2是一種泛素連接酶，是動(dòng)脈粥樣硬化的樞紐基因，參與其發(fā)展過程［24］。CUL3對(duì)維持內(nèi)皮屏障的完整性至關(guān)重要，CUL3突變的患者可表現(xiàn)出嚴(yán)重的早發(fā)性高血壓、血管功能障礙和動(dòng)脈僵硬［25］。ANAPC4是細(xì)胞周期后期促進(jìn)復(fù)合物的核心亞基之一，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期從中期到后期進(jìn)展的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子［26］，而細(xì)胞周期的運(yùn)行與冠心病存在密切聯(lián)系［27］。RNF138是一種DNA損傷反應(yīng)蛋白，可參與DNA的損傷修復(fù)過程［28］，而DNA修復(fù)相關(guān)基因的缺陷可能與DNA損傷修復(fù)效能的差異有關(guān)，最終導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生［29］。HACE1是一種E3泛素連接酶，可以通過參與自噬介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解來對(duì)心臟起保護(hù)作用［30］。SIAH1是泛素蛋白連接酶的一種，可參與細(xì)胞自噬過程［31］。UBE2D1是三類泛素化酶之一，其有助于選擇性降解短壽命蛋白質(zhì)或異常蛋白質(zhì)［32］。

本研究GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，通脈養(yǎng)心丸在多條與冠心病相關(guān)的通路上發(fā)揮重要作用，在老年女性與男性冠心病患者中，其均與泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路有關(guān)。研究表明，泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路能夠防止患者動(dòng)脈粥樣硬化病情進(jìn)展［33］，從而進(jìn)一步調(diào)控和緩解冠心病病情。泛素化對(duì)于自噬的誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)和微調(diào)節(jié)至關(guān)重要［34］，而自噬是程序性細(xì)胞死亡的形式，參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［35-36］。通脈養(yǎng)心丸中雞血藤中的黃酮類化合物與泛素-蛋白酶體途徑有關(guān)，可抑制蛋白酶體活性，從而介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的病理變化［37］。本研究組認(rèn)為，通脈養(yǎng)心丸可通過調(diào)節(jié)女性患者CUL5、UBA3基因的表達(dá)，男性患者CUL3、SIAH1、UBE2D1基因的表達(dá)，來維持內(nèi)皮屏障的完整性、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低細(xì)胞死亡率等，從而達(dá)到治療疾病的目的。

在老年女性患者中，通脈養(yǎng)心丸治療冠心病還與晝夜節(jié)律通路相關(guān)。晝夜節(jié)律是指一種周期約為24 h的生物節(jié)律，與睡眠、飲食、情緒、代謝等多方面的功能有關(guān)［38-39］。女性雌激素受體受晝夜節(jié)律影響［40］，且介導(dǎo)雌激素可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長或修復(fù)以及一氧化氮的釋放等，從而保護(hù)心血管系統(tǒng)［41］。研究表明，晝夜節(jié)律紊亂會(huì)影響心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［42］。通脈養(yǎng)心丸中的五味子能夠治療失眠類疾?。?3］，雞血藤能夠調(diào)節(jié)失眠和抑郁情緒［16］，阿膠和大棗能夠提高雌激素水平［44-45］。本研究組認(rèn)為，通脈養(yǎng)心丸可通過調(diào)節(jié)FBXL3的表達(dá)來調(diào)控晝夜節(jié)律，改善患者睡眠情況和情緒狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)激素水平等，進(jìn)而達(dá)到治療老年女性冠心病患者的目的。

綜上所述，通脈養(yǎng)心丸治療不同性別老年冠心病患者具有多靶點(diǎn)和多通路協(xié)調(diào)的特點(diǎn)，在老年女性患者中，其作用機(jī)制主要與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞自噬、炎癥反應(yīng)、鐵代謝、生物鐘、激素調(diào)節(jié)等有關(guān)；在老年男性患者中，其作用機(jī)制主要與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞自噬、DNA損傷修復(fù)等有關(guān)。本研究對(duì)冠心病的臨床治療和通脈養(yǎng)心丸的二次開發(fā)提供了一定參考，但本研究是基于生物信息學(xué)方法進(jìn)行的預(yù)測和分析，數(shù)據(jù)僅來源于GEO數(shù)據(jù)庫中所納入的治療前后不同性別患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本，研究結(jié)果可能存在一定偏倚，通脈養(yǎng)心丸治療冠心病的具體作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：秦莉花進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；李子瀅撰寫、修訂論文；王國佐、黃娟負(fù)責(zé)資料收集、整理；李晟負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析。

本文無利益沖突。