冠心病患者血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19和微小RNA-22表達(dá)水平及其臨床意義研究

高珩，李媛媛，郭鋒偉，王雪

冠心病（coronary heart disease，CHD）主要由沉積在血管中的脂質(zhì)形成粥狀白色斑塊引起［1］。隨著血管中脂質(zhì)沉積量的增加，血液循環(huán)受阻，進(jìn)而導(dǎo)致心臟缺血［2］。據(jù)報(bào)道，我國(guó)CHD患者每年的死亡率約為0.11%，是影響公民健康的重要危險(xiǎn)因素［3］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是兩類非編碼RNA，是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，研究表明lncRNA和miRNA在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及診斷治療中具有重要作用［4-5］。另外，炎性反應(yīng)也是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的原因，是CHD發(fā)生的重要機(jī)制［6］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、內(nèi)皮素1（endothelin 1，ET-1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）與CHD的發(fā)生密切相關(guān)［7］。本研究旨在探究lncRNA H19和miR-22在CHD患者血清中的表達(dá)水平及其對(duì)CHD的診斷價(jià)值、與炎性因子水平的相關(guān)性，以期為臨床CHD的診斷和治療提供一定理論支持。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年6月至2021年6月在陜西省人民醫(yī)院就診的CHD患者113例作為試驗(yàn)組，并選擇同期于本院體檢的健康志愿者88例作為對(duì)照組。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合第8版《內(nèi)科學(xué)》［8］中CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且造影顯示至少1支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%；（2）臨床資料完整；（3）年齡35～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤者；（2）近3個(gè)月內(nèi)有外科手術(shù)史或創(chuàng)傷史者；（3）嚴(yán)重肝腎功能障礙者；（4）合并嚴(yán)重自身免疫性疾病，或服用免疫抑制劑者；（5）合并血液傳染性疾病或近期有中重度感染者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡35～75歲；（2）無(wú)心力衰竭、CHD、先天性心臟病、大動(dòng)脈炎等心血管相關(guān)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重肝腎功能障礙者；（2）合并惡性腫瘤或不能控制的高血壓者；（3）有嚴(yán)重腦栓塞、腦出血病史者；（4）合并自身免疫性疾病或近半年服用免疫抑制劑者；（5）合并中重度血液傳染性疾病者。試驗(yàn)組中男62例，女51例；年齡35～75歲，平均（54.6±8.8）歲。對(duì)照組中男45例，女43例；年齡35～73歲，平均（53.2±7.4）歲。兩組受試者性別（χ2=0.277，P=0.599）、年齡（t=1.021，P=0.076）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)陜西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，受試者均對(duì)本研究知情同意。

1.2 RT-PCR檢測(cè)受試者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平 采集受試者清晨空腹外周血5 ml，3 000 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm），取血清；采用RNA提取試劑盒（GenEluteTM，Sigma）提取血清總RNA；采用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，檢測(cè)合格后取1 g 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA〔InRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，KR202-01；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，KR211；天根生化科技（北京）有限公司〕；采用RT-PCR檢測(cè)lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平，嚴(yán)格按照Quant SYBR Green PCR試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕操作；引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分別以β-actin和U6為內(nèi)參。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 ELISA法檢測(cè)血清炎性因子、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平 采用ELISA檢測(cè)血清炎性因子、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平，前者包括IL-6、TNF-α、hs-CRP，后者包括VEGF、ET-1，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用ROC曲線評(píng)估血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平及其聯(lián)合診斷CHD的價(jià)值；兩變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平比較 試驗(yàn)組患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum expression level of lncRNA H19 and miR-22 between the two groups

表2 兩組受試者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum expression level of lncRNA H19 and miR-22 between the two groups

組別 例數(shù) lncRNA H19 miR-22對(duì)照組 88 1.14±0.40 1.05±0.28試驗(yàn)組 113 1.87±0.44 1.59±0.43 t值 -9.871 -10.529 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 兩組受試者血清炎性因子、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平比較 試驗(yàn)組患者血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組受試者血清炎性因子水平、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum levels of inflammatory factors and endothelial function indexes between the two groups

表3 兩組受試者血清炎性因子水平、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum levels of inflammatory factors and endothelial function indexes between the two groups

注：IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α，hs-CRP=超敏C反應(yīng)蛋白，VEGF=血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，ET-1=內(nèi)皮素1

E T-1（n g/L）對(duì)照組 8 8 3 8.8±1 3.5 1 1.8±4.7 6.5±1.7 9 5.8±3 5.3 4 7.9±1 0.6試驗(yàn)組 1 1 3 1 3 2.5 ±1 6.8 3 7.6±5.4 1 9.4±5.6 5 3 5.6±9 3.8 1 0 9.0±2 3.6 t值 1 2.5 5 7 1 2.7 4 8 8.6 3 2 1 5.3 5 9 1 0.8 6 5 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1組別 例數(shù) I L-6（n g/L）T N F-α（n g/L）h s-C R P（m g/L）V E G F（n g/L）

2.3 血清lncRNA H19、miR-2表達(dá)水平及其聯(lián)合診斷CHD的價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平及其聯(lián)合診斷CHD的AUC分別為0.827〔95%CI（0.770，0.884）〕、0.817〔95%CI（0.758，0.876）〕、0.894〔95%CI（0.850，0.938）〕，最佳截?cái)嘀捣謩e為1.44、1.39、0.64，靈敏度分別為78.1%、65.8%、76.3%，特異度分別為79.4%、85.2%、89.8%，Youden指數(shù)分別為0.565、0.510、0.661，見圖1。

圖1 血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平及其聯(lián)合診斷CHD的ROC曲線Figure 1 ROC curve of serum expression level of lncRNA H19, miR-22 and their combination for the diagnosis of CHD

2.4 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平與炎性因子、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平的相關(guān)性分析 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平與IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平均呈正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表4 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平與炎性因子、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平的相關(guān)性Table 4 Correlation between serum expression level of lncRNA H19,miR-22 and levels of inflammatory factors, endothelial function indexes in CHD patients

3 討論

CHD是嚴(yán)重影響人類健康的重要疾病之一，近年來其發(fā)病率逐漸上升，且發(fā)病年齡越來越年輕化。世界上80%以上的心臟猝死是由CHD引起的，其余病例是由其他疾病引起的，包括心肌病、先天性心臟病、左心室肥厚、主動(dòng)脈瓣疾病和其他心臟?。?］。目前CHD的診斷和治療已取得較大的進(jìn)步，但每年CHD的發(fā)病率及死亡率仍不容忽視［10］。所以，CHD的早期預(yù)防和診斷對(duì)于降低其病死率尤為重要。

lncRNA是一類長(zhǎng)度為200 nt的非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、自噬等過程。既往研究表明，lncRNA與心血管疾病有關(guān)［11-13］。同樣，miRNA是一類包含約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過誘導(dǎo)mRNA降解或阻斷翻譯來轉(zhuǎn)錄和控制基因表達(dá)，與各類疾?。òㄐ难芗膊。┑陌l(fā)生有關(guān)［14-15］。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平升高。且血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平及其聯(lián)合診斷CHD的AUC分別為0.827、0.817、0.894，最佳截?cái)嘀捣謩e為1.44、1.39、0.64，靈敏度分別為78.1%、65.8%、76.3%，特異度分別為79.4%、85.2%、89.8%，Youden指數(shù)分別為0.565、0.510、0.661，表明血清lncRNA H19表達(dá)水平聯(lián)合血清miR-22表達(dá)水平對(duì)CHD的診斷價(jià)值更高。仉慧穎等［16］研究發(fā)現(xiàn)，CHD患者血清lncRNA H19表達(dá)水平升高，且其對(duì)CHD的發(fā)生有明顯的促進(jìn)作用，本研究結(jié)果與之相似。有研究發(fā)現(xiàn)，與完全無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的急性心肌梗死組織相比，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，miR-22表達(dá)水平明顯升高［17］。所以lncRNA H19和miR-22在CHD的發(fā)生中有重要作用。

ZHANG等［5］進(jìn)一步探究lncRNA對(duì)CHD的調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL可作為促進(jìn)WDR5和HDAC3結(jié)合形成WDR5和HDAC3復(fù)合物的分子支架，其通過上調(diào)活性氧水平，促進(jìn)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。還有研究表明，lncRNA MALAT1在CHD患者血清和內(nèi)皮祖細(xì)胞中過度表達(dá)，并且其可通過調(diào)控miR-15b-5p/MAPK信號(hào)軸和mTOR信號(hào)通路來抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞自噬，提高細(xì)胞活力，同時(shí)抑制心肌細(xì)胞凋亡［18］。lncRNA可以作為miRNA的“分子海綿”，進(jìn)而形成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響細(xì)胞生物學(xué)行為；或直接通過介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路，或通過表觀遺傳學(xué)而影響生物學(xué)過程［19-20］。以上研究表明，lncRNA、miRNA在CHD的發(fā)生中有非常重要的意義，且不同的lncRNA和miRNA在CHD的發(fā)生中作用不同。后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步從細(xì)胞生物學(xué)層面探究lncRNA H19和miR-22對(duì)CHD發(fā)生的調(diào)控機(jī)制。

CHD的發(fā)病機(jī)制過于復(fù)雜，但通常為動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）引起的管腔狹窄或閉塞，從而阻礙正常血液循環(huán)。研究表明，炎性反應(yīng)在AS的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。血管炎性反應(yīng)可改變血管壁的形狀，引發(fā)血栓形成，并促進(jìn)AS斑塊從穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇嗳鯛顟B(tài)，從而誘發(fā)栓塞并引發(fā)各種心腦血管疾?。?1］。有研究表明，lncRNA、miRNA與CHD患者血清炎性因子水平有一定相關(guān)性［22］。劉俊逸等［23］研究表明，LncRNA TUG1與血清炎性因子IL-6水平呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平高于對(duì)照組，且CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平與IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平均呈正相關(guān)，提示lncRNA H19和miR-22可通過調(diào)控炎性因子、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平而影響CHD的發(fā)展。

綜上所述，CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平升高，其對(duì)CHD有一定診斷價(jià)值，且二者聯(lián)合的診斷價(jià)值更大；此外，其與血清炎性因子、內(nèi)皮功能指標(biāo)水平均呈正相關(guān)。但本研究未探討血清lncRNA H19、miR-22表達(dá)水平與CHD患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性，在后期可通過隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：高珩進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫論文，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；王雪進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、論文修訂；高珩、李媛媛進(jìn)行資料收集；郭鋒偉進(jìn)行資料整理；高珩、王雪負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。