維生素E乳膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

任志銀，師桂英，蔣瑩

（北京市肛腸醫(yī)院，北京 100120）

維生素E乳膏為O/W型乳膏制劑，易于鎖水保濕，涂擦方便。其主要成分維生素E 為自由基清除劑，具有較強(qiáng)的抗氧化性，可使細(xì)胞膜的脂質(zhì)免受自由基氧化的損害，減少細(xì)胞色素的沉積[1-2]。維生素E乳膏也是本院的特色自制劑，主要成分為維生素E及乳膏基質(zhì)2號(hào)（包括硬脂酸、鯨蠟醇、羊毛脂、丙二醇、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、尼鉑金乙等），用于保護(hù)皮膚及防止皸裂，臨床上多用于治療凍瘡、皮膚干燥皸裂等癥狀，效果明顯，無(wú)不良反應(yīng)?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅進(jìn)行維生素E的鑒別，為完善和提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加維生素E的含量測(cè)定，本研究旨在開展含量測(cè)定的方法學(xué)研究?！吨袊?guó)藥典》2015年版[3]中收錄維生素E的含量測(cè)定方法采用氣相色譜法，但該法目前在醫(yī)療機(jī)構(gòu)難于普及，故未采納。本研究以100%色譜甲醇為流動(dòng)相，維生素E在284 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，且與雜質(zhì)峰分離度較好，保留時(shí)間適宜，測(cè)定效率高，操作簡(jiǎn)便[4-7]。本研究參考《中國(guó)藥典》2015年版四部[3]方法及《北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》具體內(nèi)容及多篇文獻(xiàn)調(diào)研[8-11]，開展制劑進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性研究，為制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供具體依據(jù)，以期使制劑質(zhì)量的可控制性更好，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)更加合理、完善，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津，SPD-M20A檢測(cè)器、LC Soulation工作站）；DHP9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；WHS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BSC-1100IIB2-X生物安全柜（山東博科生物科技有限公司）；LMQC-50E 立式壓力蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.2 試劑與藥品 維生素E對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100062-201110）；維生素E 乳膏（北京市肛腸醫(yī)院制劑室制備提供，批號(hào)：180401、180402、180403）；無(wú)水乙醇等試劑為分析純，甲醇為色譜甲醇；純化水為制劑室自制。無(wú)菌十四烷酸異丙酯、pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)180121）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：180211）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180123）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180217）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180122）均購(gòu)自北京三藥科技開發(fā)公司；金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌株均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，且使用第三代培養(yǎng)物。

1.3 方法

1.3.1 維生素E鑒別 取本品1 g，加無(wú)水乙醇10 ml溶解，濾過(guò)，加硝酸2 ml，搖勻，75 ℃加熱約15 min，溶液顯橙紅色。

1.3.2 微生物限度檢查方法學(xué)研究 ①試驗(yàn)菌液的制備。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌的試驗(yàn)菌菌懸液，以及黑曲霉的孢子懸液按照2015 年版藥典四部通則項(xiàng)制備[1-2]。②需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證。同時(shí)設(shè)置試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組，采用常規(guī)平皿法。③供試液制備。取維生素E 乳膏10 g，加入無(wú)菌十四烷酸異丙酯25 ml，再加入3%聚山梨酯和0.3%卵磷脂pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，水浴40 ℃加熱攪拌使樣品充分溶解，振蕩混勻，制成濃度為1∶10供試液。

A.試驗(yàn)組。需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)：分別取1∶10供試品溶液9.9 ml 置于無(wú)菌試管中，分別加入0.1 ml 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液，使每1 ml 供試液中的含菌量＜100 cfu，取1 ml 上述供試液置平皿中（每組平行制備2個(gè)平皿），立即加入20 ml溫度不超過(guò)45 ℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻、凝固，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)：分別取白色念珠菌和黑曲霉的供試液1 ml 至平皿中，立即注入20 ml 溫度不超過(guò)45 ℃熔化的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻、凝固后在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。B.供試品對(duì)照組。取供試液1 ml 至平皿中，立即傾注相應(yīng)培養(yǎng)基，同試驗(yàn)組方法測(cè)定供試品對(duì)照組細(xì)菌數(shù)。C.菌液組。取適量濃度的0.1 ml試驗(yàn)菌液，加3%聚山梨酯和0.3%卵磷脂pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至10 ml，混勻，制成1 ml含菌量＜100 cfu的菌懸液，分別吸取1 ml至各自平皿中，并分別加入20 ml培養(yǎng)基搖勻，待凝固后，置藥典規(guī)定的條件下培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)，每種菌的供試液各平行制備2個(gè)平皿，試驗(yàn)重復(fù)3 次，記錄菌落數(shù)，取平均值。D.回收率的計(jì)算?；厥毡戎?（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)。所有試驗(yàn)菌的回收比值應(yīng)為0.5～2.0。

2 結(jié)果

2.1 微生物限度檢查方法適用性回收比值 維生素E乳膏3個(gè)批次樣品的微生物限度檢查計(jì)數(shù)按以上方法試驗(yàn)，并記錄數(shù)據(jù)，見表1。結(jié)果表明試驗(yàn)菌的回收比均為0.5～2.0，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)中，白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均為0.5～2.0，說(shuō)明常規(guī)平皿法可以有效應(yīng)用于維生素E乳膏中的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的測(cè)定。

表1 微生物限度檢查方法適用性回收比值Table 1 Applicability recovery ratio of microbial limit test method

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn) 取1∶10供試液10 ml，分別加入相應(yīng)試驗(yàn)菌后搖勻（內(nèi)含菌液＜100 cfu/ml）后，加入到100 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，作為試驗(yàn)組。再分別制備陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組，依照藥典中相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。維生素E乳膏的控制菌檢查按常規(guī)法進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，常規(guī)法控制菌均可以有效檢出，無(wú)明顯抑菌作用，見表2。

表2 控制菌檢查試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of control bacteria

2.3 維生素E的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：100%色譜甲醇，檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量20 μl，理論塔板數(shù)不低于7 000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取維生素E 對(duì)照品135.2 mg，精密稱定，置于50 ml 容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml 含維生素E 2.704 mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品適量（相當(dāng)于維生素E 250 mg），加少量甲醇，80 ℃加熱溶解,搖勻，使基質(zhì)分散融化，放冷至室溫，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻1 h，取出后迅速濾過(guò)，放至室溫，作為供試品溶液。

2.3.4 陰性樣品溶液 制備維生素E 乳膏時(shí)不加入維生素E 原料，其他制備方法不變，作為陰性樣品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜，專屬性試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 維生素E乳膏HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of vitamin E cream

2.5 線性關(guān)系 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分別置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（Y）和峰面積為縱坐標(biāo)（X）做直線回歸，得維生素E 的校正曲線數(shù)據(jù)為Y=5E+06X+29 569，R=0.999 8。從曲線可知，在測(cè)定濃度為0.54～2.7 mg/ml 時(shí)線性關(guān)系良好。

2.6 儀器精密度試驗(yàn) 精密量取維生素E 對(duì)照品溶液20 μl，按照2.3.1中色譜條件，重復(fù)檢驗(yàn)6次，分別測(cè)定其峰面積，試驗(yàn)結(jié)果RSD為0.26%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取本品適量（約相當(dāng)于維生素E 250 mg），加少量甲醇，80 ℃加熱溶解,搖勻，使基質(zhì)分散融化，放冷至室溫，置100 ml容量瓶中，加色譜甲醇并稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻1 h，取出后迅速濾過(guò)，放至室溫，作為供試品溶液。分別在0、2、4、6、12 h測(cè)定，結(jié)果維生素E峰面積RSD為1.34%，表明供試品在室溫條件下放置12 h穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（180401）的維生素E 乳膏樣品6 份，按照2.3.3 的方法制備供試品溶液，測(cè)定其峰面積，按2.3.1 中的色譜條件，分別進(jìn)樣20 μl測(cè)定，結(jié)果計(jì)算RSD為1.17%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取9份處方量基質(zhì)，分別加入維生素E 標(biāo)示量的80%、100%、120%，按照2.3.3 中的方法配制供試品溶液，測(cè)定其加入量，每個(gè)濃度平行測(cè)定3份。按2.3.1中的色譜條件，分別進(jìn)樣20 μl測(cè)定，結(jié)果計(jì)算RSD為1.38%（n=9），回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 3 Test results of sample addition recovery(n=9)

2.10 樣品含量測(cè)定 取3 批制劑樣品，按照2.3.3中配制供試品溶液，按2.3.1 中色譜條件，分別進(jìn)樣20 μl，并分別測(cè)定峰面積，計(jì)算維生素E 的含量，3批制劑成品（維生素E 乳膏，批號(hào)：180401、180402、180403）的含量分別為標(biāo)示量的106.01%、105.88%、105.95%。

3 討論

《中國(guó)藥典》2015 年版中收錄維生素E 的含量測(cè)定方法為氣相色譜法，但未收錄維生素E 乳膏的含量測(cè)定方法。由于維生素E易溶于乙醇、甲醇、丙酮等，不易溶于水，故采用甲醇溶解和冷卻制劑成品制備供試液，可有效提取維生素E，便于高效液相色譜法檢測(cè)，流動(dòng)相為100%的色譜甲醇，操作簡(jiǎn)單快捷，且方法學(xué)準(zhǔn)確度及精密度高，可快速有效測(cè)定維生素E乳膏的含量，符合制劑生產(chǎn)的檢測(cè)需要。

《中國(guó)藥典》2015 年版較《中國(guó)藥典》2010 年版[12]收錄微生物限度檢查的方法有較多修訂內(nèi)容，在培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)條件、檢測(cè)方法、限度標(biāo)準(zhǔn)等方面均明顯區(qū)別[13-14]，因此，微生物限度檢查方法需要重新進(jìn)行驗(yàn)證，開展相應(yīng)方法學(xué)研究。本研究結(jié)果表明，微生物計(jì)數(shù)檢查5 種試驗(yàn)菌的回收比值均為0.5～2.0，控制菌檢查方法可檢出銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌。維生素E乳膏中其他多種原料成分未有明顯抑菌作用，因此，采用常規(guī)法進(jìn)行維生素E乳膏的微生物限度檢查。

醫(yī)院制劑是醫(yī)院品牌效應(yīng)的重要組成，制劑的質(zhì)量與療效密切相關(guān)，因此，應(yīng)不斷完善制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而建立高水平的制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的方式作為檢驗(yàn)方法，應(yīng)用于制劑質(zhì)量控制，更好地為患者提供高質(zhì)量、更安全的醫(yī)院制劑。本研究可為有效推動(dòng)醫(yī)院制劑規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化提供經(jīng)驗(yàn)參考。