氟化鈉殼聚糖凝膠對乳牙釉質(zhì)抗酸能力的影響

邱賽男，臧睿覺，梅予峰，張曉旻，曹 靈，周紅艷

Stomatology,2022,42(1):68-71，91

兒童因飲食習(xí)慣及有限的口腔衛(wèi)生清潔能力，乳牙齲病高發(fā)，氟化物的使用可以有效地控制齲病的發(fā)展。pH值較低的酸會造成牙釉質(zhì)的釉柱本身及釉柱間隙的脫礦溶解，酸持續(xù)作用會造成牙齒表面的溶解伴發(fā)釉質(zhì)的軟化，并最終造成結(jié)構(gòu)缺損。本實(shí)驗(yàn)首先配制氟化鈉殼聚糖凝膠，觀察其基本性能；然后使用氟離子選擇電極檢測殼聚糖氟化鈉凝膠氟離子的釋放速率；最后比較氟化鈉殼聚糖凝膠及其他藥物預(yù)處理后的乳牙釉質(zhì)試件在酸蝕后的脫出鈣離子濃度，探討氟化鈉殼聚糖凝膠的抗酸能力。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年9月—12月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科拔除的乳前牙28顆(已征得患兒及家長同意)。要求乳前牙沒有齲壞，磨耗量適中保證唇面釉質(zhì)的面積大小，釉質(zhì)表面沒有裂紋，拔除時(shí)注意不要用力過猛，造成不必要的裂紋。

1.2 儀器與試劑

配制氟化鈉殼聚糖凝膠及檢測所需：殼聚糖(Sigma 448877)，氟化鈉(AR，無錫亞盛化工)，鹽酸(AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，β-甘油磷酸鈉(AR，sigma)，總離子強(qiáng)度緩沖液Ⅱ(TISAB Ⅱ，南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室提供)，去離子水。大型磁力攪拌儀(國華)，制冰機(jī)(三洋)，DD-2B電極電位儀(江蘇姜堰市光大儀器廠)，pH儀(FiveEasy)，燒杯。

試件釉質(zhì)處理和抗酸實(shí)驗(yàn)所需：乳酸(AR，滬試)，抗酸指甲油(美寶蓮)，原子吸收分光光度計(jì)(德國耶拿，AAS vario 6型)。

1.3 配制5%氟化鈉殼聚糖凝膠及性能測定

制備0.05 mol/L的鹽酸100 mL，放入殼聚糖，室溫?cái)嚢?4 h，制備出飽和的殼聚糖鹽酸溶液。使用離心機(jī)，去除多余的殼聚糖粉末，保留上清。將殼聚糖上清液置于廣口瓶中，高壓蒸汽滅菌30 min，靜置冷卻到常溫，放入4 ℃冰箱備用。pH儀測定殼聚糖鹽酸溶液的pH值，去離子水配制56%(質(zhì)量濃度)的β-甘油磷酸鈉溶液。

取2 mL殼聚糖鹽酸溶液，加入0.189 4 g NaF(參考多樂氟5%NaF濃度配制)，逐滴滴加β-甘油磷酸鈉溶液1.2 mL，在冰水浴下攪拌均勻，配制成5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的殼聚糖氟化鈉凝膠。

肉眼觀察其顏色、質(zhì)地、性狀等，倒置實(shí)驗(yàn)觀察其流動性，pH儀測定殼聚糖氟化鈉凝膠的pH值。

1.4 氟化鈉殼聚糖凝膠釋氟速率檢測

精確稱取4.2 g NaF，與100 mL去離子水混合，配制0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)氟化鈉溶液，使用TISAB Ⅱ緩沖，甘汞氟離子選擇電極測定，獲取氟離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

制備三份殼聚糖氟化鈉凝膠樣本，甘汞氟離子選擇電極測定出氟離子的釋放濃度。

1.5 釉質(zhì)抗酸實(shí)驗(yàn)

1.5.1 釉質(zhì)試件準(zhǔn)備 拔出的乳前牙，用金剛砂平頸緣去除牙根，橡皮輪拋光釉質(zhì)表面，三用槍沖洗表面30 s后，置于去離子水中，4 ℃冰箱保存。存放24 h后，取出乳前牙，使用低速切割機(jī)縱向切除部分舌側(cè)硬組織，留約3 mm厚唇側(cè)硬組織片。試件唇側(cè)釉質(zhì)中央預(yù)留3 mm×3 mm的實(shí)驗(yàn)區(qū)域，其余部分用抗酸指甲油涂3遍，待指甲油干燥后，置于去離子水中，4 ℃冰箱保存。

1.5.2 試件釉質(zhì)處理 試件隨機(jī)分成4組，每組7片，用吸水紙吸干試件表面的水分。三組在實(shí)驗(yàn)區(qū)分別均勻地涂上氟化鈉殼聚糖凝膠、殼聚糖空白凝膠、多樂氟，另一組不作處理作為空白對照。各組釉質(zhì)片在經(jīng)歷了5 min的酸蝕處理后，以Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)(表1)評定。

表1 Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)

上藥處理后，樣本置于燒杯中，加入去離子水，保持整體的濕潤環(huán)境，并放入37 ℃恒溫箱中4 h。取出各組試件，用尖刀片輕柔去除表面附著的藥物，用三用槍沖洗試件30 s，置于去離子水中備用。

1.5.3 釉質(zhì)抗酸實(shí)驗(yàn) 配制0.1 mol/L的乳酸溶液，常溫測定pH值為4.0。每一組的試件分別浸泡于5 mL 0.1 mol/L乳酸溶液，酸蝕5 min，取出試件，用3 mL去離子水沖洗，收集各樣本的酸蝕溶液和沖洗液8 mL。溶液進(jìn)行火焰原子吸收分光光度法檢測溶液中鈣離子的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)值錄入SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析，不同組的鈣離子濃度進(jìn)行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 殼聚糖氟化鈉凝膠基本性能

殼聚糖氟化鈉凝膠常溫下呈淡黃色粘稠清亮液體，pH=6.98。放置在37 ℃恒溫箱內(nèi)，3 min初步凝固，10 min后從恒溫箱內(nèi)取出，呈軟白色果凍狀凝膠，質(zhì)軟(圖1)。

左側(cè)為殼聚糖氟化鈉凝膠常溫下保存；右側(cè)為殼聚糖氟化鈉凝膠經(jīng)10 min 37 ℃恒溫箱保存

2.2 殼聚糖氟化鈉凝膠釋放率

氟化鈉標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)氟離子選擇電極測定氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)為y=41.143x-66.667(x軸Ig濃度，y軸為氟離子選擇電極的測定值)；線性相關(guān)指數(shù)R2=0.934 5(圖2)。

圖2 氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 不同組釉質(zhì)試件酸蝕后使用Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分

圖3 殼聚糖氟化鈉凝膠釋放曲線

各組吹干5 s后發(fā)現(xiàn)不透明的斑塊，均為1級計(jì)分，潮濕牙面無明顯異常，其中殼聚糖空白凝膠組和空白對照組表現(xiàn)的色澤較殼聚糖氟化鈉凝膠組及多樂氟組要更白，通透性更差。

2.4 不同組釉質(zhì)試件乳酸溶液中鈣離子濃度比較

氟化鈉殼聚糖凝膠、殼聚糖空白凝膠、多樂氟、對照組鈣離子濃度分別為(4.29±0.65)、(7.20±0.88)、(4.22±0.34)、(7.34±1.41)mg/L。氟化鈉殼聚糖凝膠組與多樂氟組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與殼聚糖空白凝膠組及空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且鈣離子濃度低于殼聚糖空白凝膠組及空白對照組。

3 討 論

氟化物是公認(rèn)的防齲藥物之一，從20世紀(jì)初就已經(jīng)開始進(jìn)行應(yīng)用，具有降低釉質(zhì)溶解度和促進(jìn)釉質(zhì)再礦化、影響致齲細(xì)菌代謝、改變牙齒萌出后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，從而具有防齲的功效[1]。含氟產(chǎn)品的使用可以是患者進(jìn)行的自我保健方法，也可以是專業(yè)的口腔醫(yī)生給予的專業(yè)預(yù)防操作保健。對于兒童來說，使用含氟牙膏的量及含氟漱口水的用量控制尤為重要，因?yàn)閮和暮芰屯萄实呐浜夏芰τ邢?，過量氟化物的使用，會引起兒童的中毒反應(yīng)。所以臨床上對兒童用氟的指導(dǎo)理念是小于4歲的不宜局部用氟，也不推薦使用含氟牙膏及含氟漱口水，而是由臨床醫(yī)生進(jìn)行含氟涂料或凝膠的涂布操作。

Chau等[2]證實(shí)，氟化物可以抑制細(xì)菌生物膜的形成，且其活性與時(shí)間有一定的相關(guān)性。其在用量和次數(shù)上有更多的限制，這樣對于控制氟的過量攝入有很好的保證。涂料在操作方式和方法上和凝膠有相似之處，都需要保持釉質(zhì)的干燥，在藥物涂布完后一定時(shí)間內(nèi)不喝水不吃東西，從操作的簡便性上看，并不是很復(fù)雜的操作。不過操作的難度和兒童對命令以及行為控制的配合程度有關(guān)[3]。

歐洲兒科牙科學(xué)會(EAPD)發(fā)布的氟化物應(yīng)用指南[4]指出兒童含氟凝膠較涂料的操作要更簡單，清潔完牙面只需患者佩戴牙合墊輕咬幾分鐘即可，操作的用量仍需要嚴(yán)格控制。多樂氟的出現(xiàn)，使得操作更為簡便，涂在釉質(zhì)表面的多樂氟在遇到唾液后可以硬化，只要控制兒童4 h不進(jìn)食飲水，唾液不下咽即可。

但多樂氟凝膠成本相對較貴，用殼聚糖水凝膠作為一種凝膠載體，它的原料殼聚糖是自然界中的第二大多糖甲殼素的脫乙酰基產(chǎn)物，來源豐富制取便宜，其價(jià)格便宜，同時(shí)Arnaud等[5]指出單純的殼聚糖溶液也有保護(hù)牙釉質(zhì)、抵抗酸蝕的作用。

制作殼聚糖水凝膠的過程并不復(fù)雜，完成的凝膠為智能型凝膠，溫度升高凝膠由液相向膠體相轉(zhuǎn)變，這對于凝膠的保存以及使用時(shí)的方便程度都有很好的指導(dǎo)意義。臧圣奇等[6]的實(shí)驗(yàn)通過對殼聚糖溫敏凝膠的凝膠時(shí)間、黏度、溶脹率、降解率、微觀結(jié)構(gòu)等方面的研究，肯定了殼聚糖凝膠作為組織工程支架，復(fù)合細(xì)胞、藥物、蛋白的利用價(jià)值。

殼聚糖氟化鈉凝膠的pH值接近中性，對藥物和人體組織的損害較小，生物相容性較好。作為大分子多糖，殼聚糖氟化鈉凝膠提供的空間可以作為藥物的良好載體。近年來多樂氟作為口腔局部用藥的經(jīng)典藥物，常作為評估其他藥物氟離子釋放率的參考標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn)氟化鈉殼聚糖凝膠組與多樂氟組4 h氟離子釋放率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ruel-Gariépy等[7-9]的研究證明，殼聚糖溫敏凝膠作為藥物的載體，其釋放速率與藥物的分子量有關(guān)，藥物分子量越大，釋放速率越慢，本實(shí)驗(yàn)中氟化鈉作為小分子親水藥物4 h釋放70%是可以接受的。同時(shí)Keegan等[10]制作的殼聚糖納米噴霧搭載氟化鈉，其最大搭載藥物量達(dá)到14%的氟化鈉含量，釋放率達(dá)到84.1%，證明了殼聚糖作為氟化鈉搭載載體的能力。因此本課題設(shè)計(jì)制作的殼聚糖氟化鈉凝膠是成功的，搭載了高濃度的氟化鈉，并且很好地控制了藥物的pH值，其藥物的釋放率也符合殼聚糖溫敏水凝膠的一般特性。

釉質(zhì)的早期齲壞即為釉質(zhì)表面在細(xì)菌代謝產(chǎn)物的酸蝕作用下出現(xiàn)的表面礦物質(zhì)析出，呈現(xiàn)出白堊色的色澤變化，白堊色越不明顯說明其脫礦情況越低。經(jīng)由Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[11]評定，各組都表現(xiàn)為釉質(zhì)脫礦集中在釉質(zhì)外層1/2，類似于臨床上見到的釉質(zhì)脫礦的早期齲壞。氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟處理過的試件，在肉眼觀察其白堊色時(shí)，無單純殼聚糖水凝膠和未處理組明顯。Torlakovic等[12]的研究結(jié)果說明早期齲的白色病損，其病變程度和白堊色深度呈正相關(guān)的，本實(shí)驗(yàn)的肉眼觀察結(jié)果說明氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟抑制酸蝕的能力優(yōu)于殼聚糖空白凝膠及空白對照組。

釉質(zhì)表面的酸蝕液進(jìn)行鈣離子濃度的檢測，是一種經(jīng)典的定量檢測方法Grenby[13]早在1996年釉質(zhì)檢測方法的綜述中就有詳細(xì)的描述，可以有效量化釉質(zhì)表面脫礦的程度。而且這種方法在體內(nèi)體外都可以進(jìn)行。Young等[14]驗(yàn)指出釉質(zhì)的化學(xué)檢測在體內(nèi)試驗(yàn)中需要絕對的隔絕唾液，以防止影響檢測結(jié)果，而體外實(shí)驗(yàn)的操作更加準(zhǔn)確簡便。從我們的結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)各組在酸蝕過程中脫出的鈣離子濃度是有區(qū)別的。組間的比較氟化鈉殼聚糖凝膠與多樂氟處理組析出的鈣離子濃度數(shù)值無差異，殼聚糖空白水凝膠與空白組無差異，同時(shí)氟化鈉殼聚糖凝膠、多樂氟析出的鈣離子濃度要遠(yuǎn)低于殼聚糖空白水凝膠及空白組。這說明，氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟抗酸的效果優(yōu)于殼聚糖空白水凝膠，并且效果相似，這與肉眼觀察到的結(jié)果相同，說明了氟化鈉殼聚糖凝膠與多樂氟的抗酸蝕效果。

多樂氟作為防齲處理的金標(biāo)準(zhǔn)，一直被臨床廣泛應(yīng)用，其pH值為4.5[15]，Magalh?es等[16]進(jìn)行的TiF4和NaF涂料的實(shí)驗(yàn)，指出釉質(zhì)表面在各種藥物處理后，最高可以持續(xù)抵抗酸蝕30 min。同時(shí)Arnaud的實(shí)驗(yàn)[5]報(bào)道，殼聚糖溶液涂抹在釉質(zhì)表面產(chǎn)生的抗酸效果是殼聚糖本身滲透入釉質(zhì)層產(chǎn)生抗酸效果與本研究所提及的氟化鈉殼聚糖凝膠抗酸原理不同，本研究中的氟化鈉殼聚糖凝膠與殼聚糖空白凝膠的抗酸效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且氟化鈉殼聚糖凝膠抗酸性能更好，這一效果提示其抗酸效果來自氟化物。

釉質(zhì)的檢測方法有其多樣性，主要分為定量檢測和定性檢測[17]。SEM和EDS的聯(lián)合使用，使定性和定量的研究很好地結(jié)合在一起。在抗酸蝕的過程中，肉眼對于釉質(zhì)表面的變化的觀察，在臨床應(yīng)用中起到大致的指導(dǎo)性說明作用。乳牙牙釉質(zhì)薄，平均約1 mm左右，打磨拋光制成標(biāo)準(zhǔn)試件則表面的釉質(zhì)層可能已經(jīng)剝脫，所以選用化學(xué)檢測這一經(jīng)典方法，可以更明確地指出氟化鈉殼聚糖凝膠抗酸蝕的能力。

R?lla、Saunders等[18-19]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氟化物具有保護(hù)牙體硬組織免于酸蝕傷害的作用，雖然也有文獻(xiàn)指出氟化物的保護(hù)作用有限[20]，但大多數(shù)的文獻(xiàn)支持的結(jié)論與我們研究的結(jié)果相似，殼聚糖凝膠作為載體很好地使氟化物與釉質(zhì)接觸和反應(yīng)，氟化鈉殼聚糖凝膠具有4 h的持續(xù)釋放能力，持續(xù)高濃度的氟化鈉提高了釉質(zhì)的抗酸蝕能力。

氟化鈉殼聚糖凝膠處理后的乳前牙釉質(zhì)，與金標(biāo)準(zhǔn)的多樂氟達(dá)到了一致的抗酸能力；所以氟化鈉殼聚糖凝膠有望作為防治乳牙早期齲的藥物，并應(yīng)用于臨床。