立體光固化成型氧化鋯陶瓷的生物安全性評價

趙 禎，代 康，于 海，趙 喆，高 勃

Stomatology,2022,42(1):47-52

全瓷修復(fù)體因為優(yōu)越的美學(xué)效果，良好的機(jī)械性能在口腔領(lǐng)域發(fā)展迅速[1-2]。目前牙科陶瓷材料的制作工藝主要有兩類：一類是以失蠟熱壓鑄造技術(shù)、粉漿涂塑法為代表的傳統(tǒng)方法，該方法步驟繁瑣，制作效率低下，需要消耗大量人工和時間；另一類是應(yīng)用CAD/CAM技術(shù)切削預(yù)成瓷塊的減材制造方法，該方法能快速、準(zhǔn)確、高效地制作修復(fù)體，但會造成原材料的嚴(yán)重浪費(fèi)和切削設(shè)備的較大損耗[3-5]。

增材制造技術(shù)是一種“從無到有，由少至多”的快速成型技術(shù)，具有精度高、成本低、成型速度快、可加工復(fù)雜形態(tài)等優(yōu)點[6-7]。目前已有學(xué)者將該技術(shù)應(yīng)用于口腔全瓷修復(fù)體的制作，并進(jìn)行了修復(fù)體精度和適合性的實驗[8-9]。但尚未有生物安全性實驗的系統(tǒng)報道。本研究參照GB/T 16886.5—2017[10]、GB/T 16886.10—2017[11]以及YY/T 0127.14—2009[12]、YY/T 0127.13—2018[13]對立體光固化技術(shù)制備氧化鋯陶瓷進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性實驗、皮膚致敏實驗、急性經(jīng)口毒實驗和黏膜刺激實驗，對該材料的生物安全性進(jìn)行檢測，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 立體光固化技術(shù)制備邊長4.8 mm、厚度0.68 mm的正六邊形片狀氧化鋯陶瓷試件(由嘉興饒稷科技有限公司提供)，高溫高壓蒸汽滅菌，按試件表面積與浸提液介質(zhì)3 cm2/mL的比例加入生理鹽水，置于37 ℃恒溫?fù)u床浸提72 h，0.22 μm濾器過濾除菌(細(xì)胞培養(yǎng)所用浸提液以完全培養(yǎng)基于細(xì)胞孵箱浸提24 h)。另制備直徑5 mm，厚度0.7 mm的圓片，圓片周邊制備4個等距離的、直徑小于1 mm的圓孔，用于黏膜刺激實驗。

1.1.2 試劑 CCK-8試劑(PCM，中國)，完全培養(yǎng)基(中喬新舟，中國)，L-929小鼠成纖維細(xì)胞(中喬新舟，中國)，酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀(Bio-tek，美國)，完全弗氏佐劑CFA、二硝基氯苯DNCB、十二烷基硫酸鈉(均購自Sigma，美國)。

1.2 體外細(xì)胞毒性實驗

1.3 皮膚致敏實驗

參照國標(biāo)GB/T 16886.10—2017，選擇豚鼠最大劑量實驗(GPMT)進(jìn)行皮膚致敏實驗。選取體質(zhì)量300～400 g雌性白化豚鼠30只，分為3組，每組10只。去除豚鼠背部約4 cm×6 cm區(qū)域毛發(fā)，按照圖1在豚鼠背部各區(qū)域(從頭至尾依次為A、B、C)皮內(nèi)注射0.1 mL溶液。6 d后用10%十二烷基硫酸鈉溶液涂布按摩實驗組和陽性對照組B點。24 h后各組以其B點溶液浸濕面積約15 cm2紗布，覆蓋于術(shù)區(qū)注射點，然后用一層玻璃紙覆蓋，彈性繃帶固定48 h。14 d后進(jìn)行腹部激發(fā)，將分別含有材料浸提液、生理鹽水、0.1%DNCB溶液的紗布固定于各組豚鼠腹部，24 h后拆除彈性繃帶及紗布，觀察記錄去除紗布24 h及48 h后各組豚鼠腹部皮膚情況并參照Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)[11]分級，計算各組陽性激發(fā)結(jié)果發(fā)生率。

圖1 皮內(nèi)誘導(dǎo)各位點示意圖

1.4 急性經(jīng)口毒實驗

參照醫(yī)療行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0127.13—2009，選取體質(zhì)量100～120 g SD大鼠20只(雌雄對半)，分為實驗組及對照組(雌雄對半)。使用陶瓷浸提液按5 mL/100 g體質(zhì)量的劑量對實驗組大鼠進(jìn)行灌胃，對照組大鼠以相同劑量生理鹽水進(jìn)行灌胃，每日1次，連續(xù)7 d，觀察有無異常表現(xiàn)并稱重。再正常飼養(yǎng)7 d后稱重，計算大鼠每周體質(zhì)量相對增長率，對大鼠進(jìn)行大體解剖觀察，取出主要臟器，HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.5 黏膜刺激實驗

參照醫(yī)療行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T0127.13—2018，選用體質(zhì)量110～130 g雄性金黃地鼠10只，2%戊巴比妥鈉溶液麻醉。醫(yī)用5-0縫合線將陶瓷試件穿頰縫合，試件固定在左側(cè)頰黏膜表面，同規(guī)格牙膠片縫合于右側(cè)(圖2)。術(shù)后每日觀察材料在位情況及金黃地鼠頰囊黏膜有無紅腫、破潰及全身異常等表現(xiàn)。連續(xù)觀察14 d，取兩側(cè)頰囊黏膜組織，HE染色觀察。

圖2 金黃地鼠口內(nèi)縫合照片

2 結(jié) 果

2.1 體外細(xì)胞毒性實驗

陶瓷材料浸提液培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，顯微鏡下可見實驗組及陰性組細(xì)胞幾乎完全貼壁，生長良好，透亮，折光性強(qiáng)，呈梭形和多角形，并可見圓形分裂細(xì)胞。陽性對照組細(xì)胞多呈圓形，核固縮(圖3)。體外細(xì)胞毒性實驗結(jié)果見表1，陶瓷材料浸提液不同濃度組細(xì)胞存活率均大于90%，實驗材料無潛在細(xì)胞毒性。

A：100%浸提液組；B：陰性對照組；C：陽性對照組

表1 立體光固化成型氧化鋯陶瓷細(xì)胞毒性結(jié)果

2.2 皮膚致敏實驗

參照Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)[11](表2)，實驗組及陰性對照組豚鼠在腹部激發(fā)后24、48 h，多數(shù)動物腹部無明顯改變，少數(shù)可見散發(fā)性或點狀紅斑。陽性組豚鼠腹部幾乎均可見散發(fā)性或點狀紅斑(圖4)。各組動物陽性結(jié)果發(fā)生率見表3，實驗組陽性發(fā)生率等于陰性對照組，且反應(yīng)強(qiáng)度不大于陰性對照組，材料對皮膚無致敏性。

表2 Magnusson和Kligman分級

A：實驗組；B：陰性對照組；C：陽性對照組

表3 各實驗組皮膚反應(yīng)記分結(jié)果

2.3 急性經(jīng)口毒實驗

14 d觀察周期內(nèi)，大鼠進(jìn)食飲水正常，狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，未見驚厥、嗜睡、昏迷等中毒反應(yīng)，體質(zhì)量相對增長率見表4，兩組體質(zhì)量相對增長率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大體解剖結(jié)果顯示實驗組大鼠主要臟器大小、形態(tài)、色澤未見異常(圖5)。HE染色觀察心肌細(xì)胞排列整齊，未見紊亂斷裂情況；肝小葉結(jié)構(gòu)正常，分界清楚，肝索排列規(guī)則，未見變性、萎縮、壞死等病理變化；腎小球形態(tài)、數(shù)量和分布未見異常(圖6)。

圖5 大鼠主要臟器照片

圖6 大鼠器官組織學(xué)觀察

表4 兩組大鼠體質(zhì)量相對增長率比較

2.4 黏膜刺激實驗

肉眼觀察金黃地鼠兩側(cè)頰囊黏膜材料周圍，未見明顯充血、紅腫、糜爛等異常表現(xiàn)。實驗側(cè)黏膜組織切片顯微鏡下觀察，未見上皮過度角化或角化不良，未見棘層松解、基底細(xì)胞空泡樣變等異常表現(xiàn)(圖7)。對動物進(jìn)行組織反應(yīng)評分，陶瓷材料對黏膜的刺激指數(shù)為0，對黏膜無刺激作用。

A：實驗組；B：對照組

3 討 論

傳統(tǒng)氧化鋯全瓷材料已被證實生物安全性良好[14-16]。立體光固化快速成型氧化鋯技術(shù)是將陶瓷粉末混入液態(tài)光敏樹脂，形成具有一定流動性的陶瓷漿料，再通過紫外光選擇性固化，形成陶瓷生胚，然后通過脫脂燒結(jié)得到最終的陶瓷部件。陶瓷漿料在制備過程中添加了光引發(fā)劑、增塑劑、分散劑、光敏樹脂、流變劑等物質(zhì)[17-18]，化學(xué)性質(zhì)較為復(fù)雜。這些物質(zhì)在經(jīng)過了脫脂燒結(jié)程序后已基本除凈，但在應(yīng)用于人體之前，仍需要評價其安全性[19-20]。本實驗測試的陶瓷材料擬用于臨床制作冠橋，按照醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0268—2001[21]對該類材料的評價要求， 本研究進(jìn)行了4項實驗， 初步檢測了該陶瓷材料的生物安全性。

體外細(xì)胞毒性實驗廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價[22-23]。常用的細(xì)胞毒性定量實驗有MTT法和CCK-8法，這兩種方法通過檢測活細(xì)胞新陳代謝強(qiáng)度來對活細(xì)胞的數(shù)量和功能狀態(tài)進(jìn)行評價。CCK-8法操作簡便，結(jié)果重復(fù)性高，無毒性，相較于MTT法更加靈敏安全，故本研究選擇CCK-8法進(jìn)行實驗。細(xì)胞經(jīng)過不同濃度浸提液培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞均形態(tài)良好，增殖率>90%。該結(jié)果同王文俊等[24]的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果類似，證實了立體光固化氧化鋯陶瓷無細(xì)胞毒性。

豚鼠皮膚中的朗格漢斯細(xì)胞能將抗原傳遞給特異性淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞中有一小部分為具有長壽命的記憶細(xì)胞，它們在激發(fā)階段作為初始激活因子，當(dāng)豚鼠皮膚再次接觸該抗原時，便發(fā)生了致敏反應(yīng)。本實驗中，陰性組和實驗組大部分豚鼠腹部皮膚無明顯變化，而陽性組幾乎均出現(xiàn)了散發(fā)性或點狀紅斑。由于陰性組生理鹽水無致敏作用，在24 h出現(xiàn)的3例紅斑反應(yīng)和48 h出現(xiàn)的2例紅斑反應(yīng)，可認(rèn)為是由彈性繃帶固定引起的皮膚刺激，屬于本實驗系統(tǒng)的背景反應(yīng)[25]。陰性對照組中出現(xiàn)反應(yīng)的動物數(shù)目如果不超過實驗動物數(shù)的50%，不會對結(jié)果產(chǎn)生影響[26]，因此本實驗結(jié)果是有效的。按照Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)[11]，實驗組陶瓷材料對皮膚無致敏性。

急性經(jīng)口毒性實驗是評估材料毒性特性的一種方式，通過短時間經(jīng)口染毒可提供對健康危害的信息。實驗采用灌胃給藥的方式，保證了給藥劑量, 可準(zhǔn)確地評價材料的毒性。14 d觀察期內(nèi)大鼠狀態(tài)良好，無明顯中毒體征，處死大鼠肉眼觀察重要臟器未見異常，HE染色觀察組織切片無萎縮、水腫、壞死等病理變化，表明該材料無短期全身毒性。

金黃地鼠的頰囊黏膜菲薄，血管豐富且形態(tài)清晰，是黏膜刺激實驗的良好動物模型。實驗期間各組金黃地鼠進(jìn)食、飲水正常，反應(yīng)靈活，毛發(fā)光澤整齊，HE染色實驗組未見異常，組織評分結(jié)果證實該陶瓷對口腔黏膜無刺激。

上述4個生物安全性實驗結(jié)果互相印證，表明立體光固化氧化鋯陶瓷無細(xì)胞毒性、無致敏性、無黏膜刺激作用及短期全身毒性，可認(rèn)為該材料具有良好的生物安全性。

所有作者聲明不存在利益沖突。